一株具有溶磷和降解苯酚能力的假单胞菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有溶磷和降解苯酚能力的假单胞菌及其应用。本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas?sp.)，它的菌株编号为113443，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC?No.7840。本发明的假单胞菌(Pseudomonas?sp.)113443CGMCC?No.7840有较强的溶磷和降解有毒污染物的能力，其苯酚降解率可达100%。本发明的假单胞菌(Pseudomonas?sp.)113443CGMCC?No.7840适用于土壤和沉积物中难溶态磷的降解、盐碱环境土壤中磷活性的增强，可以有效提高生态系统内磷的有效性，从而促进植物的吸收。
【专利说明】一株具有溶磷和降解苯酚能力的假单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株具有溶磷和降解苯酚能力的假单胞菌及其应用。
【背景技术】
[0002]磷是生物生长的主要营养元素之一，其在自然状态下以可溶态和难溶态两种形式存在。植物可吸收利用可溶态磷，而难溶态磷在生态系统中含量较可溶态磷高，且难被植物吸收利用。已有研究表明，微生物可降解难溶态磷，因此，开发高效的溶磷微生物，将难溶态磷转化为可被植物利用的活性磷具有重要的实用价值。
[0003]苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料或中间体。含酚废水的排放导致水体污染，鱼虾死亡，农作物减产，并严重威胁人类的健康。微生物因其丰富的代谢能力和强大环境适应性可用来降解有机污染物。目前，已报道的微生物对苯酚的降解能力有限，开发能完全降解苯酚的功能微生物具有重要的社会生态价值。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一株具有溶磷能力和高效降解苯酚的假单胞菌及其应用。
[0005]本发明所提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.),它的菌株编号为113443,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7840。
[0006]假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的 16s rDNA 序列如 SEQ IDN0.3所示，革兰氏染色为阴性。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840。
[0008]所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0009]根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
[0010]所述菌剂可为下述Al)、A2)或A3):
[0011]Al)降解酚(如苯酚)和将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂；
[0012]A2)降解酚(如苯酚)的菌剂；
[0013]A3)将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂。
[0014]含有假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生物膜或生物膜反应器也属于本发明的保护范围。
[0015]所述生物膜或生物膜反应器可为下述B1)、B2)或B3):
[0016]BI)降解酚(如苯酚)和将难溶态磷转化为可溶性磷的生物膜或生物膜反应器；
[0017]B2)降解酚(如苯酚)的生物膜或生物膜反应器；
[0018]B3)将难溶态磷转化为可溶性磷的生物膜或生物膜反应器。
[0019]该生物膜具体是由人工填料或天然材料作为载体,所述假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840附着絮凝其表面形成的膜状物。
[0020]所述假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 在制备 Cl)、C2)或 C3)菌剂中的应用也属于本发明的保护范围:
[0021]Cl)降解酚(如苯酚)和将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂；
[0022]C2)降解酚(如苯酚)的菌剂；
[0023]C3)将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂。
[0024]上述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840、上述菌剂、上述生物膜或生物膜反应器在降解酚(如苯酚)中的应用，或在将难溶态磷转化为可溶性磷中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025]上述应用中，将难溶态磷转化为可溶性磷可为将土壤和沉积物中难溶态磷转化为可溶性磷。上述将难溶态磷转`化为可溶性磷中的应用，所述假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840在20_40°C转化100_200h。在本发明的一个实施方式中，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在28°C转化48小时，可溶性磷的浓度最闻。
[0026]上述应用中，所述降解酚(如苯酚)可为降解液体中的苯酚。所述液体可为含有苯酚的任何液体，如含有苯酚的水体。上述降解酚(如苯酚)中的应用，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在 20_40°C 降解 20_60h (如 28-60 小时)。在本发明的一个实施方式中，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840对25mg/L的苯酚28 V降解28小时，苯酚的降解率达到82.8%_98.2%，对25mg/L的苯酚28 V降解60小时，苯酚的降解率达到100%。在本发明的另一个实施方式中，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 对 50mg/L 的苯酚 28°C 降解 28 小时，苯酚的降解率达到20.6%-40.0%,对50mg/L的苯酚28°C降解60小时，苯酚的降解率达到93.6%-98.1%。
[0027]上文中，所述难溶态磷为难被植物吸收利用的磷，如难溶态磷酸盐。在本发明的一个【具体实施方式】中，所述难溶态磷酸盐为磷酸钙。
[0028]所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840可在用于培养假单胞菌的培养基中培养。其适宜培养条件为:pH7.5，温度20-40°C。
[0029]上述菌剂、上述生物膜或生物膜反应器的制备方法，包括将所述假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 作为活性成分的步骤。
[0030]本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840有较强的溶磷和降解有毒污染物的能力，其苯酚降解率可达100%。本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840适用于土壤和沉积物中难溶态磷的降解、盐碱环境土壤中磷活性的增强，可以有效提高生态系统内磷的有效性，从而促进植物的吸收。本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840同时适用于含苯酌.有机废水的处理,可以使废水中苯酚残留含量符合排放标准。本发明解决了自然状态下磷元素的利用效率低和废水中苯酚去除效果不高的问题，降低了生产和使用成本，对于保护生态环境及人类健康具有重要的意义。
[0031]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0032]保藏说明
[0033]菌种名称:假单胞菌(Pseudomonas sp.)
[0034]菌株编号:113443
[0035]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0036]保藏机构简称:CGMCC
[0037]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0038]保藏日期:2013年07月02日
[0039]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7840
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在磷酸钙固体培养基形成的解磷圈。
[0041]图2 为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在磷酸钙，“磷酸钙 +磷酸二氢钾”，磷酸二氢钾三种不同磷源处理培养基中溶磷比较分析(可溶性磷酸盐浓度按K2HPO4的量计算)。
[0042]图3 为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在磷酸钙，“磷酸钙 +
磷酸二氢钾”，磷酸二氢钾三种不同磷源处理培养基中的生长量。
[0043]图2 和图 3 中，Ca3 (PO3) 2 表示 Pl 培养基，Ca3 (PO3) 2+ΚΗ2Ρ03 表示 P2 培养基，KH2PO3表不P3培养基。
[0044]图4为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在溶液A中对苯酚的降解和菌体生长分析。“苯酚”表示未接种假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A，“苯酚+菌”表示接种假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A，“菌生长曲线”表示接种假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液A中假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 的生长情况。
[0045]图5 为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源为 5Omg/L苯酹时对苯酹的降解和菌体生长分析。“苯酹”表示未接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液B，“苯酚+菌”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液B，“菌生长曲线”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 B 中假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生长情况。
[0046]图6 为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源为“25mg/L苯酌.+5g/L葡萄糖”时对苯酹的降解和菌体生长分析。“苯酹”表示未接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液C，“苯酚+菌”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液C，“菌生长曲线”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 C 中假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的生长情况。
[0047]图7 为假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 在碳源为“50mg/L 苯酚+5g/L葡萄糖”时对苯酹的降解和菌体生长分析。“苯酹”表示未接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液D，“苯酚+菌”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的溶液D，“菌生长曲线”表示接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840 的溶液 D 中假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840的含量。
【具体实施方式】
[0048]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]下述实施例中的磷酸钙固体培养基均按照如下方法配制:取IOg葡萄糖、
0.5g (NH4)2SO4^0.3g NaCl、0.3g KCl、0.3g MgSO4.7Η20、0.03g FeSO4.7Η20、0.03gMnSO4.Η20、5.0g Ca3 (PO4) 2、15_20g 琼脂，用 H2O 定容至 1000mL,调整培养基 pH 至 7.0-7.5，105°C灭菌 30min。
[0050]下述实施例中的培养基均为无菌培养基。
[0051]实施例1、假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 的分离和鉴定
[0052]一、菌株的分离
[0053]取Ig采集的北京官厅水库底泥，加入IOOmL无菌水震荡5min,将悬浊液倒入250mL装有十颗玻璃珠无菌 三角瓶中，25°C摇床振荡30min，取上清液逐级稀释至10_4，各取
0.1mL涂布于磷酸钙固体培养基平板上，每个浓度重复3皿，29.(TC培养5d，筛选具有溶磷圈的菌株，将分离纯化所得的一株具有明显溶磷圈的菌株命名为菌株113443。
[0054]二、菌株的鉴定
[0055]菌株113443的革兰氏染色为阴性。
[0056]利用PCR对菌株113443的16s rRNA进行扩增，上游引物为8F (序列如SEQ IDN0:1所示)，下游引物为1492R (序列如SEQ ID NO: 2所示)，扩增条件为95°C，5min ;95°C，111^11，501:，1111丨11，721:，2111丨11，25个循环；72°C, IOmin0 菌株 113443 的 16s rRNA 的 DNA 序列如SEQ ID N0.3所示。将该序列在Genbank数据库进行BLAST(网址:http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，结果该序列与假单胞菌(Pseudomonas veronii)菌株 PH-5的相似性为99%。
[0057]根据菌株113443的16s rDNA序列同源性分析结果，将菌株113443鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas),本发明中称其为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443已于2013年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.7840。
[0058]实施例2、假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840溶憐能力的研究
[0059]一、假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840在固体培养基中溶磷能力的测试。[0060]将假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840用接种针接种到磷酸钙固体培养基上，28°C培养5d，同时以没有接种假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCCN0.7840的磷酸钙固体培养基为对照，观察测量菌落直径及溶磷圈直径，根据公式(I)计算其溶磷效果。实验设三次重复。
[0061]溶解磷系数=(溶磷圈直径/菌落直径)X 100 (I)
[0062]结果表明假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840可以在憐酸钙固体培养基上形成明显的透明圈见图1，溶磷能力评估见表1，未接种假单胞菌(Pseudomonassp.) 113443CGMCC N0.7840的磷酸钙固体培养基上没有溶磷圈。
[0063]表1 假单胞菌(Pseudomonas sp.) 113443CGMCC N0.7840 解憐能力的评价
[0064]
【权利要求】
1.假单胞菌(Pseudomonassp.),它的菌株编号为113443,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7840。
2.菌剂，其活性成分为权利要求1所述的假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于:所述菌剂为下述Al)、A2)或A3): Al)降解酚和将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂； A2)降解酚的菌剂； A3)将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂。
4.含有权利要求1所述的假单胞菌的生物膜或生物膜反应器。
5.根据权利要求4所述的生物膜或生物膜反应器，其特征在于:所述生物膜或生物膜反应器为下述B1)、B2)或B3): BI)降解酚和将难溶态磷转化为可溶性磷的生物膜或生物膜反应器； B2)降解酚的生物膜或生物膜反应器； B3)将难溶态磷转化为可溶性磷的生物膜或生物膜反应器。
6.权利要求1所述的假单胞菌在制备C1)、C2)或C3)菌剂中的应用: Cl)降解酚和将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂； C2)降解酚的菌剂； C3)将难溶态磷转化为可溶性磷的菌剂。
7.权利要求1所述的假单胞菌、权利要求2或3所述的菌剂、权利要求4或5所述的生物膜或生物膜反应器在降解酚中的应用。
8.权利要求1所述的假单胞菌、权利要求2或3所述的菌剂、权利要求4或5所述的生物膜或生物膜反应器在将难溶态磷转化为可溶性磷中的应用。
9.培养权利要求1所述的假单胞菌的方法，包括将所述权利要求1所述的假单胞菌在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。
10.权利要求2或3所述的菌剂、权利要求4或5所述的生物膜或生物膜反应器的制备方法，包括将权利要求1所述的假单胞菌作为活性成分的步骤。
【文档编号】A62D101/20GK103820365SQ201410058179
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】吴晓磊, 陈卫民, 孙艳梅, 池昌桥 申请人:北京铁汉生态环境科学研究院有限公司, 北京大学