专利名称：一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌种构建领域，尤其是一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
苯酚是ー种有毒有机的化工原料，是エ业废水废渣中的主要污染物，我国把苯酚列入严重污染环境和危害人体健康优先污染物的“黑名単”之中。 目前，采用微生物降解含酚废水因耗能少、成本较低、二次污染少等优点成为了处理含酚废水的常用的方法之一。研究学者从自然界中筛选分离出来能够降解苯酚的高效微生物菌种，通过研究其降解特性、降解条件、对苯酚的耐受性以及降解效率，进而有针对性地将菌剂投入到污水处理系统中，得到较好的处理效果。杨彦希等从炼油厂附近严重污染的废水和土壌中通过富集分离筛选到12株丝孢酵母及假丝酵母，这12株菌都能够以苯酚为唯一碳源生长，24-28h内降解苯酚质量浓度可高达1200mg/L,其中一菌株降解苯酹质量浓度最高可达1700mg/L。袁丽娟等从ー绝缘材料厂的污水中分离得到一株可高效降解苯酹的菌株Bacillus simplex JY01,在接种量为2%，pH为6. 0-9. 0，温度为18°C _36°C的条件下，在30h内，当苯酚浓度为IlOOmg/L和1300mg/L时，其降解率分别为99. 16%和74. 76%。显然，通过筛选菌株，引入高降解活性菌株能够提高含酚废水的降解率，其意义是重大的。但是对于这些难降解的污染物，仅靠自然界中的微生物有时是不够的，如何使这些优良菌株长期地在生物处理系统中占优势，并保持其高降解活性是我们需要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废水的ー个关键问题，其中向微生物中引入编码相应酶的基因进行菌株改造，是解决这ー问题的主要途径，也可以说工程菌的构建前景是肯定的。微生物好氧降解苯酚的代谢过程是微生物利用苯酚羟化酶将苯酚氧化为邻苯ニ酚，邻苯ニ酚由邻位和间位途径经环裂解最終形成こ酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等，这些产物进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用，一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为ニ氧化碳和水，提供微生物新陈代谢作需的能量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明从铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAOl中克隆的苯酹羟化酶基因，通过克隆、表达苯酚羟化酶基因构建苯酚降解菌工程菌。本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的一种降解苯酚的基因工程菌，含有苯酚羟化酶基因。而且,所述苯酹轻化酶基因来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01。而且，所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342。一种降解苯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤如下
(I) PCR扩增苯酚羟化酶基因从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PAOl中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段，正向引物见序列I，反向引物见序列2，PCR扩增获得苯酚羟化酶基因；(2)重组质粒的构建用BamHI和SalI进行双酶切PCR产物，与同样经过BamHI和SalI双酶切的克隆表达载体PWB980相连接；⑶转化将步骤(2)的连接产物转入E. coli DH5a感受态中，取150 μ L转化产物，涂布于 包含卡那霉素的LB平板上，370C，210-230rpm过夜培养，挑取单菌落，分装含有卡那霉素的LB培养基，37°C，210-230rpm培养8-15h，提取质粒，重组质粒经PCR及酶切鉴定目的片段已经插入了载体，将验证成功的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342中，获得降解苯酚的基因工程菌。一种降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的应用。本发明的优点和积极效果是I、本发明从铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosaPAOl基因组中克隆到一个编码苯酚羟化酶基因，通过DNA重组技术在体外克隆表达构建得到苯酚降解菌，并进一歩验证本重组菌降酚特性，获得了对苯酚的具有较强降解能力的遗传工程菌，这将对苯酚降解菌的エ业化生产提供新的理论依据。2、本发明中表达的苯酚羟化酶是苯酚降解过程中关键酶，通过克隆和表达苯酚羟化酶基因获得降解苯酚的工程菌，为酶法或生物法高效降解苯酚提供了很好的实现途径。3、本发明构建的重组菌对各种浓度的苯酚皆有较好的降解能力，在35h内重组菌对浓度为 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L 苯酚的降酚率分别为100%,100%,100%,98. 87%,85. 24%,78. 11%。
图I 为本发明 PCR 扩增结果，其中 M :100bp DNA Markerl, 2, 3,4, 5PCR product ；图2为本发明枯草芽孢杆菌表达蛋白的SDS-PAGE分析，其中，M :Protein marker,I :空白菌发酵上清液，2 :重组菌发酵上清液。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中涉及的百分比如果无特殊标明，均为重量百分比。一种降解苯酚的基因工程菌，构建方法如下I、PCR扩增苯酚羟化酶基因从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PAOl中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段。(I)设计如下引物
正向引物CGCGGATCCATGAAGCTGTACGCCATTTTTGATGCCTTC
该引物含有BamH I限制性内切酶识别位点；反向引物ACGCGTCGACGGTAGCCGCGCCAGAACCATTTGTC该引物含有Sal I限制性内切酶识别位点；(2) PCR反应体系均为50 μ I :10 X 缓冲液 buffer :5 μ L ;上游引物I μ L ;下游引物I μ L ；dNTP : I μ L ;模板I μ L ；Taq 酶0. 5 μ L ；ddH20 :40. 5 μ L ⑶PCR 程序①94°C IOmin②②5 个循环94°C lmin, 58°C Imin, 72°C Imin ;5 个循环94°C lmin, 57°C lmin,72°C lmin ;25 个循环94で lmin,56°C lmin,72°C lmin③72°C IOmin(4)PCR产物确定将上述得到的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，同时加上IOObp Ladder对PCR产物进行初歩鉴定测序，确定是否得到正确的目的片段。经电泳分析，在约600bp左右出现I条特异性条带，大小与预期值相符(图I)。切胶回收纯化目的片段并进行测序，测序结果与NCBI苯酚羟化酶基因(注册号GQ396163. I)进行比对。结果表明目的基因全长为601bp，而且序列与所报道的序列一致，已经成功扩增出目的片段。2、重组质粒的构建用BamH I和Sal I进行双酶切PCR产物，与同样经过BamH I和Sal I双酶切的克隆表达载体PWB980相连接，连接反应体系(10 μ L)如下无菌水5 μ L，10 X缓冲液buffer I μ L pffB980载体(25ng/ μ L) :2 μ L，新鲜PCR产物I μ L，T4DNA连接酶I μし此反应操作在冰上进行，将反应产物置于16°C，过夜。3、转化将步骤2的连接产物通过化学转化方法转入E. coli DH5 α。其具体步骤为①在冰上融化Ε. coli DH5 α感受态细胞用移液器吸取10 μ I连接产物加入到感受态细胞中，用枪头轻柔搅拌混匀②冰浴30min，42°C热激细胞90s，不要摇动，请移至冰浴③每个反应中加入800 μ ILB培养基，在37°C摇床中，以220rpm的转速水平振荡Ih④取150 μ L转化产物，涂布于包含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C过夜培养，⑤挑取单菌落，分别接种于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基，37 °C，220rpm培养10h，提取质粒。重组质粒经PCR及双酶切鉴定目的片段已经成功插入了表达载体。将验证成功的重组质粒转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB1342)中。其中枯草芽孢杆菌((Bacillus subtilis DB1342)感受态制备方法及所用培养基如下(I)枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液IOX Spizizen salts母液15%K2HPO4 ·3Η20，0· 6% KH2PO4, 2% (NH4)2SO4,0. 2% MgSO4,1 % 柠檬酸钠，溶于蒸馏水中。115°C,6. 6 X IO4Pa高压灭菌20min，室温贮存。10%酵母粉、I %水解酪蛋白和25mmol/LMgCl2，6.6X104Pa高压灭菌；20%葡萄糖、025%组氨酸和O. ImoVLCaCl2，用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌待用。⑵枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基IOmL GMI ImLlOXSpizizen salts,O. lmL10%酵母粉，O. 25mL20%葡萄糖，O. 2mLl %水解酪蛋白，O. 2mL0. 25%组基酸，补充灭菌蒸懼水至总体积10mL。10mT ,GMT T ImLlO X Spizizen salts, 0/05mL10 % 酵母粉，O. 25mL20 % 葡萄糖，O. 04mLl % 水解酪蛋白，O. 2mL0. 25 % 组氨酸，O. 05mL0. lmol/LCaCl2, lmL25mmol/LMgCl2，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。(3)枯草芽孢杆菌感受态细胞制备方法挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB1342)单菌落接种于2. 5mLGMI培养基中，30°C 130_150r/min振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量接种于
2.5mL新鲜的GMI中，37°C 200_230r/min振荡培养3. 5h ;再以10%接种量将培养物接种于5mLGM II中进行第二次传代，37°C，200_230r/min振荡培养90min ;取ImL培养物，5000r/min室温离心5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。(4)重组质粒转化取验证成功重组质粒加至上述所制的枯草芽孢杆菌感受态细胞悬液中，至终浓度lg/mL，质粒体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37°C水浴中静置30_60min，37°C 200r/min振荡培养2_4h，取150 μ L转化产物，涂布于包含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置过夜培养(李瑞芳，薛雯雯，黄亮等，枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究。生物技术通报[J]，2011 (5) :227-230)。4、重组质粒的高效表达及SDS-PAGE电泳分析挑取含所需质粒的单菌落至5mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，37で、220rpm振荡过夜培养，次日以3%接种量接种于200mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C培养至菌液浓度OD6tltl = O. 7-1. O时，用浓度为O. 4mmol/L的IPTG诱导，未诱导菌作对照，25°C诱导表达14h,取ImL菌液于12000r/min离心2min收集上清液，同样的程序做空白菌(枯草芽孢杆菌DB1342)的对照，各取重组菌和空白菌上清10 μ I分别与10 μ I上样缓冲液混合，沸水浴lOmin，离心取上清进行SDS-PAGE (12%分离胶、5%浓缩胶)电泳检测蛋白表达情况(图2)。由图2的SDS-PAGE电泳分析表明，重组菌上清在22kDa处出现一条特异性条带，与预期苯酚羟化酶分子量大小相符，而空白菌在22kDa处无条带，说明了苯酚羟化酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。5、重组菌耐酚能力及降酚能力的測定将含有苯酚羟化酶基因的重组枯草芽孢杆菌接种于20mL的LB培养液中，37°C、200r/min过夜摇培，再以2 %的接种量接种到50mL分别含300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L苯酚的唯一碳源培养基中(培养基具体成分为=KH2PO4O. 5g，K2HPO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· 2g, CaCl2O. lg, MnSO4 · H2OO. 03g, FeSO4 · 7H200. 03g, NH4NO3L Og加水到1L，根据所需添加不同苯酚量)同时以不加菌的相同培养基作为对照，37°C、200r/min摇培，每隔5h取5mL样品测定苯酚的含量，来考査重组菌对苯酚的降解能力及耐受力。 苯酚含量的測定方法采用4-氨基安替吡啉直接吸光光度法。
測定结果表明，重组菌对各种浓度的苯酚皆有较好的降解能力。在35h内重组菌对浓度为 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L 苯酚的降酚率分别为100%,100%,100%,98. 87%,85. 24%,78. 11%。同时也测定了枯草芽孢杆菌((Bacillussubtilis DB1342)对苯酚的降解率，发现该菌对苯酚的利用率特别低，在含有苯酚的唯一碳源培养基中几乎不能生长。说明经过改造的菌株除了具有本身的ー些特性外，还获得了降解苯酚能力的新性状，而且该菌株比一些通过富集、分离、筛选得到的降解苯酚优势菌具有更强的降酚能力及耐受性。经过检测本重组菌株对苯酚的耐受性高于2000mg/L，而且在35h内对2000mg/L苯酚的降解率高达78. 11%。、与本发明相关的对比菌的苯酚降解情况I、刘惠、丛燕燕、叶瑶等利用梯度压力驯化筛选法从油田污泥中得到一株革兰氏阴性苯酚降解菌PHE-2，该菌株对苯酚浓度为400mg/L的苯酚降解率在26h后达到80%以上,38h后达99%以上,该菌能耐受的最高苯酹浓度为500mg/L,当苯酹浓度大于500mg/L时，该菌的生长受到抑制，但对苯酚的降解能力仍较强(刘惠、丛燕燕、叶瑶，赵孝保，顾中铸.油田污泥中苯酚降解率的筛选及降解苯酚研究.中国给水排水，2009，25 (19)88-90.)。2、潘利华，姜绍通，刘鹏达等从某印染厂下水道的污泥中分离到ー株能高效降解苯酹的菌株Phl6,经初步鉴定为微球菌属(Micrococcus sp.)。该菌株最高可耐受I. 5g/L左右的苯酹，该菌降解苯酹最适条件为Ph7. O,温度35°C,苯酹浓度I. Og/L,时间36h,通气有利于苯酚的降解，降解率可达99. 6% (潘利华，姜绍通，刘鹏达，李慧星.苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J].微生物学通报，2003，30 (5) :78-81.)。3、何晓丽，陈晨，傅盈盈等从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到一株能够利用并降解苯酚的菌株P2。通过苯酚降解实验证实，该菌能在30°C，192h内完全降解500mg/L的苯酚(何晓丽，陈晨，傅盈盈，陈璐等.一株苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J].生物学杂志，2010，I (27) :31-35.)。通过以上数据对比可得该重组菌株在对苯酚的降解能力及耐受性方面具有优势，这将为采用生物方法处理含酚废水提供可靠的方法，对苯酚降解菌的エ业化生产提供新的理论依据。
权利要求
1.一种降解苯酚的基因工程菌，其特征在于含有苯酚羟化酶基因。
2.根据权利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于所述苯酚羟化酶基因来自铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa PAOl。
3.根据权利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis DB1342。
4.一种如权利要求I或2或3所述的降解苯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤如下 (1)PCR扩增苯酚羟化酶基因 从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PAOl中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段，正向引物见序列1，反向引物见序列2，PCR扩增获得苯酚羟化酶基因； (2)重组质粒的构建 用BamH I和Sal I进行双酶切PCR产物，与同样经过BamH I和Sal I双酶切的克隆表达载体PWB980相连接； (3)转化 将步骤(2)的连接产物转入E. coli DH5a感受态中，取150 ii L转化产物，涂布于包含卡那霉素的LB平板上，30-450C，210-230rpm过夜培养，挑取单菌落，分装含有卡那霉素的LB培养基，30-450C，210-230rpm培养8_15h，提取质粒，重组质粒经PCR及酶切鉴定目的片段已经插入了载体，将验证成功的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisDB 1342中，获得降解苯酚的基因工程菌。
5.一种权利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用，含有铜绿假单胞杆菌PA01中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序，构建步骤包括(l)PCR扩增苯酚羟化酶基因；(2)重组质粒的构建；(3)转化，还包括其在降解苯酚中的应用。本发明从铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa PA01基因组中克隆到一个编码苯酚羟化酶基因，通过DNA重组技术在体外克隆表达构建得到苯酚降解菌，并进一步验证本重组菌降酚特性，获得了对苯酚的具有较强降解能力的遗传工程菌，这将对苯酚降解菌的工业化生产提供新的理论依据。
文档编号C12N1/21GK102660489SQ20121012068
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者张同存, 杨晶, 赵华, 陈坤 申请人:天津科技大学