专利名称：一种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其编码的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种经过改造的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其编码的酶，以及含有该基因的工程菌，属于植物基因工程和酶工程领域。
背景技术：
垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)为卷柏科卷柏属植物,俗称“九死还魂草”。它一般多生长在荒山秃岭及干旱的岩石缝中，极耐干旱，也耐寒。在天气干旱的时候，小枝就卷起来，缩成一团，以保住体内的水分。一旦得到雨水，气温升高，卷缩的小枝会平展开来。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物一一海藻糖。海藻糖又称酵母糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子通过a-1，I糖苷键连结而成的非还原性糖，其理化性质十分稳定，能够在高温、高寒、高盐和干燥失水等恶劣条件下对生物细胞起到保护作用。海藻糖作为渗透调节物质通过渗透调节来维持高的细胞质渗透压，保证在干旱胁迫下细胞的正常生理功能；在缺水情况下，可以保持细胞膜的液体流动相，防止细胞膜通透性增加，出现融合现象；可以替代水分子通过氢键作用参与肽链折叠，维持在缺水情况下蛋白质的空间结构和功能。在逆境条件下对蛋白质、核酸和生物膜等生物活性物质和细胞结构的保护均起到非常重要的作用，并且海藻糖在糖代谢途径中起着信号转导的作用，可通过抑制己糖激酶的活性从而调节葡萄糖进入糖酵解。在生物体内，海藻糖的生物合成过程为先由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP)和 6_ 磷酸葡萄糖反应生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphatephosphatase, TPP)的作用下脱磷酸,最终生成海藻糖。其中，海藻糖_6_磷酸合成酶是该合成途径中的一个关键酶；不同生物体内的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特点，如在编码基因和结构等方面即存在着明显的差异。目前人们研究海藻糖的主要策略之一，是通过对海藻糖上述合成途径相关基因的克隆与表达研究，增强其合成途径的代谢，从而实现海藻糖在生物体内的富集。其中海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)成为主要关注对象之一。本申请的申请人通过同源扩增的方法成功地从垫状卷柏中克隆出TPS基因的全长序列(SEQID NO. 3所示的序列)，经过转化相应的酵母突变体证明所克隆的序列为功能性的TPS基因。但是许多研究发现植物来源的TPS基因和微生物来源的TPS基因相比，在其5’端发现有一段冗余的碱基序列，该序列对TPS酶活有一定的影响。为了获得酶活性更高的TPS，需要对已克隆出来的TPS基因进行相应的修饰改造，并对其功能进行验证，以期为转基因技术获得更优良的外源基因。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因及其编码的酶，以及含有该基因的工程菌，通过功能验证，SpTPSl A编码的TPS酶活性更高。
本发明是通过以下技术方案实现的一种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，记为SpTPSl A，其核苷酸序列如下列之(I)序列表SEQID NO. I所示的序列；(2)编码序列表SEQID NO. 2所示的蛋白质序列的多核苷酸；(3)与序列表SEQID NO. I所示的序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。一种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶，其氨基酸序列如下列之一(I)序列表SEQID NO. 2所示的序列；(2)序列表SEQID NO. 2所示的序列的一个或者几个氨基酸残基进行取代、缺失或者添加的序列，其活性与序列表SEQID NO. 2所不的序列的蛋白质相同。一种含有上述改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的工程菌，所述工程菌为含有插入该基因的特定表达载体的大肠杆菌、酵母菌等常用工程菌。通过分子克隆方法得到的SpTPSl A，要插入所述表达载体，所述表达载体按照分子生物学领域的常规来构建，例如，可使用质粒DNA和适当的起始密码子、启动子、增强子以及其它元件，将它们以正确的方向连接后具有调控功能，以便实现蛋白的表达。适当的载体对本领域技术人员来说是已知的。所述SpTPSl A基因的获得方法如下(I)垫状卷柏总RNA的提取从植物垫状卷柏叶片中提取得到垫状卷柏叶片总RNA，提取方法选自如下方法中的任一种试剂盒法(Trizol法)、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法，优选试剂盒法(Trizol法)。(2) SpTPSl A 的扩增将步骤⑴提取得到的RNA作为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，采用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (TakaRa China)按照 SMART PCR cDNA SynthesisKit (Clontech USA)操作说明进行cDNA合成。然后将cDNA作为模板，以下述上游引物0RF7和下游引物0RF5进行PCR扩增0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’ ；如 SEQID NO. 4、5 所示；扩增得到的产物即为SpTPSl A片段，通过克隆测序，即得其基因序列。本发明还提供了对克隆得到的SpTPSl A基因进行酵母异源功能互补验证的方法，包括下述步骤(I)将 TPSl 酶基因缺失(tpsl A)的酵母突变菌株 YSH290 (W303-1A，ggsl/tpsl A : :TRP1,Katholieke 大学 Johan M. Thevelein 教授惠赠,Hohmann S et al. 1993)转接到含2%半乳糖的YH)培养基(I%酵母提取物、2%蛋白胨、2%半乳糖、2%琼脂，pH5. 8)上，30°C培养，醋酸锂法制备感受态细胞；(2)分别用SpTPSl A基因真核表达载体0pRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPSl醋酸锂法转化缺失突变菌株YSH290，在含2%半乳糖的组氨酸缺失培养基(0. 67%去氨基酸酵母氮碱、2%半乳糖、0.077%-His Do Supplement、2%琼脂，pH5. 8)上筛选，挑选阳性转化 子提取酵母质粒DNA，以反转录的cDNA为阳性对照，用上述特异引物(上游引物0RF7和下游引物0RF5)扩增SpTPSl A基因序列；(3)验证转化成功后，将转化子转接在含2%葡萄糖的组氨酸缺失培养基(0. 67%去氨基酸酵母氮碱、2 %葡萄糖、0. 077 %-His Do Supplement、2 %琼脂，pH5. 8)上，同时转接酵母野生菌株 W303-lA(Mataleu2-3,112ura3_l，trpl-1，his3_ll，15ade2_l，canl-lOOGAL, SUC2, Katholieke 大学 Johan M. Thevelein 教授惠赠，Thomas BJ andRothstein RJ. 1989)作阳性对照，以未转化的TPSl酶基因缺失(tpsl A)酵母突变菌株YSH290作阴性对照，30°C培养3_5d，验证转化的垫状卷柏修饰改造SpTPSl A酶基因能否恢复TPSl酶基因缺失(tpslA)酵母突变菌株的生长缺陷。为了对SpTPSl A表达酶活性进行测定，进一步证明修饰改造后的SpTPSl A基因具有更好的表达活性，本发明还提供了 SpTPSlA酶活性测定方法，测定海藻糖-6-磷酸合成酶的酶活力是根据Hottiger et al (J Bacteriol，169 :5518-5522 (1987))所述的双酶活反应进行测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是(I)通过对申请人已克隆出来的垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因进行修饰改造，获得了截短后的SpTPSl A编码基因。(2)获得了 SpTPSl A编码的酶的氨基酸序列。(3)对获得的修饰改造后的SpTPSl A基因及其编码的酶进行了功能验证采用酵母异源功能互补法对该基因进行功能验证，该方法不仅可以在植物中克隆具有特定功能的未知基因，也可以根据序列相似性，或用植物基因与相应的酵母功能缺陷突变体互补，确定某一基因的生物功能。很多植物蛋白能够和酵母突变体进行功能上的互补，从而为未知功能基因的研究提供试验依据，酵母的互补试验是阐述这些基因功能的一个有效手段；通过酶活测定进一步验证截短修饰改造的基因SpTPSl A是一个比SpTPSl全长序列更优良的基因。(4)根据该SpTPSl A基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能，可以预料如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。
图I为SpTPSl A基因扩增电泳检测结果图。图2为表达载体pRS6/AtTPSl图。图3为构建真核表达载体图。图4为酵母异源功能互补结果图，其中，(a)代表转化子在组氨酸缺陷的半乳糖培养基上的生长状况，(b)代表转化子在组氨酸缺陷的葡萄糖培养基上的生长状况，(C)代表每个三角形所图的菌株。图5为阳性转化子的检测结果图。
图6为PCR扩增反应程序
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不脱离本 发明技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。在下述各实施例中，将垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶修饰改造基因简称为A NTPS。以下实施例中使用的材料来源如下试剂PrimeScriptTMReverse Transcriptase、oligo (dT) 18、RNase Inhibitor、DTT> dNTP Mixture、RNase free ddH20、Taq DNA Polymerase、LaTaq DNA Polymerase、GC Buffer I、Trypton、Yeast Extract、DNA marker、pMD19_T 载体购自大连宝生物公司(Takara)。DEPC和DEPC处理水购于上海生物工程公司。Trizol、琼脂糖凝胶回收试剂盒、通用型产物纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于北京天根(TIANGEN)生化科技有限公司。氯仿、异丙醇、无水乙醇和无水氯化钙等常规试剂为国产分析纯，购自雅安试剂公司。限制性内切酶购于宝生物大连公司；鲑鱼精DNA购自大连宝生物公司；半乳糖(galactose,Gal)购于 Sigma 公司；Yeast Nitrogen Base ff/0 Amino acids (YNB)、-His Do Supplement 均购于Clontech公司。植物材料垫状卷柏采于四川省汉源山区，种植于盆土中，置于阴暗潮湿处(该植物材料采集于四川省汉源县九襄镇的越野之地，由蒋伟采集，联系方式13908232269，采集时间为2009年6月，采集者联系地址为四川省成都市温江区惠民路211号)。菌株本实验采用大肠杆菌E. coli DH5 a菌株作为亚克隆菌株，酵母(S. cerevisiae)表达载体 pRS6_AtTPSl 和酵母菌株 W303-1A (Mat a leu2_3,112 ura3-l,trpl-1, his3_ll ;15ade2_l, canl-lOOGAL, SUC2)(Thomas BJ and Rothstein RJ. 1989)、TPSl 突变株 YSH290 (W303-1A, ggsl/tpsl A TRP1) (Hohmann S et al. 1993)。实施例I垫状卷柏叶片总RNA的提取步骤如下(I)取垫状卷柏幼嫩叶片放入液氮预冷过的研钵，立即加入液氮，尽可能的研磨碎样品，趁液氮尚未挥发将样品按每管0. Ig分装入用液氮预冷过的I. 5mL离心管中，立即向每管加入ImL Trizol (购自Invitrogen公司)，剧烈振荡后，室温放置5min ；(2) 4°C、12000r/min离心2min,将上清液转入新的无RNase的离心管中；(3)向每管加入0. ImL 5mol/L的NaCl，混合均匀，再向每管加入0. 3mL氯仿，剧烈振荡15s后,室温放置3min, 4°C、12000r/min离心15min,在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的I. 5mL离心管中；(4)向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混匀后，室温放置lOmin，4°C、12000r/min离心IOmin,小心倒掉管中液体,保留沉淀,加入ImL 75%乙醇洗漆沉淀；(5)4°C、7500r/min离心5min,小心倒掉管中液体,保留沉淀，再加入ImL 75%乙醇洗涤沉淀，4°C、7500r/min离心5min，，所得沉淀即为垫状卷柏叶片总RNA，-20°C保存。实施例2 SpTPSl A基因的扩增步骤如下以上述实施例I所得纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligo (dT) 18为逆转录引物，米用 PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (TakaRa China)按照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit (Clontech USA)操作说明进行cDNA合成。反应体系总体积为20 ii L。
先通过比对5个已知的海藻糖-6-磷酸合成酶氨基酸序列复活卷柏TPSl (Selaginella Iepidophylla),垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim),拟南芥TPSl (Arabidopsis thaliana TPS1),酿酒酵母 TPSl (Saccharomyces cerevisiae)大肠杆菌TPSl (E. coli E. coli)进行氨基酸序列比对，与大肠杆菌和酵母TPS相比，植物来源的TPS基因在其氨基酸序列的N端都有几十个氨基酸残基的延长部分，设计相应的引物对N端的进行截短扩增SpTPSl A基因，设计一对引物如下0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGCGGCTGCTCGTTGTAGCG 3’ ；0RF5 :5’ CGC GGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC 3’。扩增体系为
权利要求
1.ー种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，其特征在于其核苷酸序列如下列之一 (1)序列表SEQIDNO. I所不的序列； (2)编码序列表SEQIDNO. 2所示的蛋白质序列的多核苷酸； (3)与序列表SEQIDNO. I所示的序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.权利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的制备方法，其特征在于步骤如下 (1)垫状卷柏总RNA的提取从植物垫状卷柏叶片中提取得到垫状卷柏叶片总RNA； (2)SpTPSl A 的扩增 将步骤(I)提取得到的RNA作为模板，以oligo (dT) 18为逆转录引物，进行cDNA合成； 然后，将cDNA作为模板，以下述上游引物0RF7和下游引物0RF5进行PCR扩增0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’ ； 扩增得到的产物即为改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在干所述步骤(I)中提取方法选自如下方法中的任ー种试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法。
4.ー种扩增权利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的引物，其特征在于包括上游引物0RF7和下游引物0RF5，其序列为0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’。
5.ー种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶，其特征在于其氨基酸序列如下列之一 (1)序列表SEQIDNO. 2所不的序列； (2)序列表SEQIDNO. 2所示的序列的一个或者几个氨基酸残基进行取代、缺失或者添加的序列，其活性与序列表SEQID NO. 2所示的序列的蛋白质相同。
6.含有权利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的工程菌。
全文摘要
本发明公开了一种改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其编码的酶，该基因具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO.1；2)编码序列表SEQID NO.2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表SEQID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。上述基因编码的TPS酶，具有SEQID NO.2所述的氨基酸的序列，或者将SEQID NO.2的一个或者几个氨基酸残基进行取代、缺失或者添加且具有与SEQID NO.2相同活性的由SEQID NO.2衍生的蛋白质。通过功能验证截短修饰改造的基因SpTPS1Δ是一个比SpTPS1全长序列更优良的基因。本发明为培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种提供了优良的外源基因。
文档编号C12N1/21GK102649964SQ201210120649
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者于好强, 付凤玲, 周树峰, 周济, 李晚忱, 赵生美, 邓龙群 申请人:四川农业大学