一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物及其应用领域，具体设及一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌 株及其应用。
【背景技术】
[0002] 饲料中使用抗生素在促进畜禽生长的同时，其弊端日益明显，包括：耐药菌株的产 生和流行、引起机体内源感染或二重感染、导致机体免疫功能下降、药物在畜产品中残留并 通过食物链影响人类健康和生态环境。2012年中国年产抗生素达21万吨，其中有近半被用 于了畜牧养殖业，国内抗生素用量分别超出美国的4倍W上、部分欧盟国家10倍W上。由 于大量使用抗生素导致畜禽肠道内微生物产生大量耐药基因，运些耐药基因随粪便一起被 排泄到外界环境。一项最新研究发现，在施用养殖场粪肥后，中国商用养猪场周围±壤中抗 生素耐药基因的种类和浓度超出森林±壤。携带耐药基因微生物可随着河流、地下水或者 农产品被扩散，给人类带来潜在健康危险。2002年世界卫生组织已提出减少食用动物中抗 生素使用的全球原则，欧盟已于2006年禁止在饲料中使用抗生素，美国也将于2015年禁止 在饲料中使用抗生素。我国也制订了禁止和逐步淘汰绝大部分饲用抗生素政策和措施，《中 国饲料工业1996~2020年发展战略》和《生产绿色食品的饲料添加剂使用准则》中也明确 规定了今后我国饲料生产和发展的方向，将逐步控制或减少传统抗生素在饲料中添加的种 类和数量，促进我国畜牧业健康可持续发展。随着《饲料和饲料添加剂管理条例》和《饲料 原料目录》的正式实施，禁用饲用抗生素也将进入实施阶段，因此开发合适抗生素替代品成 为当前最迫切任务。
[0003] 目前，国内外公认的饲料中抗生素替代品包括微生态益生菌制剂、抗菌肤、酶制 剂、中草药、植物提取物和酸化剂等6大类，在多种抗生素替代品中，益生菌由于在免疫功 能调节、肠道炎症性疾病治疗、肠道应激综合征和腹泻防治等方面发挥重要作用日益受到 重视。目前市面上在售的益生菌类产品质量良莽不齐，普遍存在菌种来源不明、宿主特异性 差、功能不明确，甚至存在鱼目混珠现象。
[0004] 动物肠道中寄住中大量微生物，其中乳酸杆菌是在动物消化道中为主要有益菌 群，其在维持肠道健康、促进机体免疫系统的发育与成熟等方面发挥重要作用。猪肠道中 乳酸杆菌有嗜酸乳酸杆菌（Xactobacillusacido地ilus)、罗伊氏乳杆菌（Xactobacillus reuteri)、植物乳酸杆菌(Xactobacillusplantarum)、纤维二糖乳酸杆菌(Xactobacillus cellobiosus)、发酵乳酸杆菌(Xactobacillusfermentum)、唾液乳酸杆菌(Xactobacillus salivirius)、短乳酸杆菌（Xactobacillusbrevis)等。罗伊氏乳杆菌（X.reuteri) 是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌，对肠黏膜 上皮细胞有较强的粘附能力。L.reuteri在抗病毒方面效果非常显著。化等发现，哺 乳仔猪饲喂L.reuteriHY25101菌株后能更有效预防PEDV感染。Seo等研究发现， Lreuteri(Probio-16)可W抑制轮状病毒对非洲绿猴上皮细胞系TF-104感染。在治疗由 轮状病毒引起腹泻上L.reuteri有明显效果，尤其是儿童。L.renteri能明显缩短由轮状病 毒导致腹泻时间，而且L.reuteri添加量越多，腹泻停止时间越快。L.reuteri能产生一种 被称为罗伊氏菌素巧euterin)的广谱抗菌物质，它能广泛地抑制大肠埃希氏杆菌、鼠伤寒 杆菌、白假丝酵母菌、枯草芽抱杆菌、黄曲霉菌、空肠弯曲杆菌及产芽抱梭菌等病菌。Frese 等比较了来自8种不同脊椎动物的Lreuteri基因组序列，发现它们之间存在根本性差异， L.reuteri为适应不同动物肠道微环境其基因组序列也发生相应改变。因此从健康动物肠 道内分离抗逆性强、功效突出的乳酸杆菌是筛选饲用益生菌重要途径之一。
【发明内容】
阳〇化]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株从健康动物肠 道筛选出的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)。该乳杆菌具有益生特征，能耐酸和耐 胆盐，抗逆性强；对肠上皮细胞粘附能力强；对猪常见致病菌具有一定的抑制作用；可抑制 产肠毒素大肠杆菌巧TECK88)对肠上皮细胞的损伤；可促进肠上皮细胞增殖；同时在体外 肠上皮细胞模型中该乳杆菌具有较强免疫调节功能。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的罗伊氏乳杆菌的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一株罗伊氏乳杆菌（Xactobacillusreuteri)，名称为罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillusreuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11154。
[0009] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl的培养条件：培养基采用MRS 肉汤培养基，P册.5,培养溫度37+rC，50~70巧m震荡培养24~4她。
[0010] 所述的MRS肉汤培养基的组成成分为：酪蛋白腺10旨/1、牛肉浸粉lOg/l、葡萄糖 20邑/1、酵母提取物5g/L、憐酸氨二钟2g/L、构祿酸钢2g/L、屯水硫酸儀0. 58g/l、四水硫酸 车孟0. 25g/l、醋酸钢5g/L、吐溫-801血/L ;抑为5. 5,121°C高压灭菌15min，放于4°C冰箱中 备用；MRS固体培养基（P册.5)只需要在灭菌前加入15g/L琼脂即可。
[0011] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl的菌落形态：LRl菌株在平板 上菌落呈现灰白色或乳白色，不透明、表面光滑、凸起、边缘整齐，直径1~1. 5mm。（如图1 所示）
[0012] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl具备抑制常见肠道致病菌能 力。
[0013] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl具备抑制肠毒素大肠杆菌 ETEC K88对肠上皮细胞的损伤的功能。
[0014] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl具备免疫调节功能。
[0015] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl具备促进肠上皮细胞增殖上 的功能。
[0016] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl在制备用于治疗肠道疾病的 制剂中的应用。
[0017] 所述的罗伊氏乳杆菌化actobacillus reuteri)LRl在促进肠上皮细胞增殖上的 应用。
[0018] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0019] 本发明提供菌株是从健康动物肠道中分离得到，安全性高，该菌株具有很好耐酸、 耐胆盐能力，抗逆性强，该菌株对常见猪致病菌有较强抑制能力，其能通过黏附、竞争占位 等方式抑制致病菌对肠上皮细胞黏附，其还可促进肠上皮细胞增殖，促进动物肠道发育成 熟，其还具有免疫调节功能。
【附图说明】
[0020] 图1是罗伊氏乳杆菌LRl在MRS平板上菌落形态图。
[0021] 图2是罗伊氏乳杆菌LRl黏附猪小肠上皮细胞系IPEC-I的结果图。
[0022] 图3是罗伊氏乳杆菌LRl抑制产肠毒素大肠杆菌K88黏附猪小肠上皮细胞系 IPEC-I的结果图。
[002引图4是罗伊氏乳杆菌LRl促进猪小肠上皮细胞系IPEC-I增殖的结果图。
[0024] 图5是罗伊氏乳杆菌LRl调控IPEC-I细胞免疫细胞因子基因mRNA表达的结果图。
[0025] 图6是罗伊氏乳杆菌LRl调控IPEC-I细胞免疫细胞因子蛋白表达的结果图。
【具体实施方式】
[00%] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0027] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
[0028] PBS溶液的制备方法如下：NaCl8.Og,KCl0. 2g，KH2PO4O. 24g，胞2册〇4? 12&0 3.