图为人小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导21天PAS染色光镜图400X; 右图为3D对照组PAS染色400X。
[0039] 图11为人小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导21天细胞色素CYP3A4功能检测柱 形图。
[0040] 图12为人小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导21天细胞色素CYP2C19功能检测 柱形图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0042] 实施例1
[0043] 取材：人小诞腺来源于临床手术时需要切除的患者小诞腺组织，手术切取后，放于 预先加有完全培养基的离屯、管中，4°C保存。
[0044] 预处理切取小诞腺组织：将组织转移到培养皿中，用小剪刀去除多余的结缔组织， 分离得到完整的小诞腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约Imm3的碎块。
[0045] 所述预处理切取小诞腺组织的过程中，将组织转移到培养皿中后，还可W向培养 皿中加入小劑提取物培养液，浸泡lOmin，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的 小诞腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约Imm3的碎块。运样处理后的小 诞腺组织在后续贴壁培养过程中，能缩短培养时间。
[0046] 所述的小劑提取物培养液采用如下方法制备：将小劑晒干，磨成粉末，过200筛， 然后加5倍重量的70%乙醇溶液回流提取3次，合并滤液，活性炭脱色，蒸干，得到白色粉末 状物质，采用去离子水配置成质量分数1 %的溶液，制成小劑提取物培养液。
[0047] 原代培养（组织块贴壁法）：用小綴子将将组织碎块均匀的铺于培养瓶底部，间距 平均5mm，添加5ml角质细胞培养基，竖立放于培养箱中。6至8小时后放倒培养瓶，使组织 块完全浸在培养液中。=天后首次观察，弃去未贴壁的组织块和液体，重新加入5ml角质细 胞培养基，W后每3天换液一次。
[0048] 细胞传代培养：组织块长出的原代细胞包括碟卵石状或铺路石状的小诞腺上皮 干/祖细胞（图1)，当细胞达到70-80%融合时，进行传代。吸走培养瓶中原有培养基，用 1XPBS洗涂细胞2次，吸去PBS。加入适量0. 25 %膜酶，轻轻旋转，使膜酶均匀覆盖培养器 皿表面，37°C消化2-3分钟，显微镜下可见上皮干/祖细胞细胞间隙增大，细胞形态变圆。 此时加入含10%FBS完全培养基终止消化。再次用吸管吸取液体，轻轻反复3-5次吹打培 养器皿表面，使上皮干/祖细胞彻底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离屯、管中，再向培养瓶中加 入IXPBS洗1-2次，并将洗液一并转移至离屯、管中。离屯、（244g，5分钟），吸去上清液。 弃去上清，加入5mL上皮细胞培养基重悬细胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液，取样 计数。接种细胞悬液于培养皿中（图2)。之后细胞每3天更换上皮细胞培养基，第一次按 1 : 1传代，之后按1 : 3或1 : 4传代。
[0049] 人小诞腺上皮干/祖细胞扩增能力测定：
[0050] 克隆形成率：分别选择=株第5、10、15代的人小诞腺上皮干/祖细胞进行克隆形 成率实验。细胞生长至80-90%融合时，消化细胞。用梯度法稀释细胞悬液并计数，最后取 200细胞接种于1个60mm培养皿中，共接种3个皿，每皿加入5ml上皮细胞培养基，放入 37°C，5%C02解箱中培养。每3天更换上皮细胞培养基，并进行拍照。约2周后肉眼可见 集落形成时进行吉姆萨兰染液染色，进行克隆计数，拍照。计数方法：计数每个皿中的集落 数，集落中少于50个细胞的不计入。克隆形成率=计数的集落数/接种的细胞数。结果见 表1。
[0051] 表1.小诞腺上皮干/祖细胞克隆形成率
[0053] 生长曲线及倍增时间：分别测定第5、10、15代的小诞腺上皮干/祖细胞的增殖速 率。细胞生长至80~90%融合时，消化。细胞消化后，取样计数，W2Xl(f/孔的密度接种 96孔板，每组细胞设5个复孔，每组细胞接种35孔，平分7块96孔板。每孔加入200UL上 皮细胞培养基/皿，放入37°C，5%C02解箱中培养。培养每3天更换上皮细胞培养基。从接 种开始24h后为第1天，第1、2、3、4、5、6、7天，每天取一块96孔板用MTT比色法测0D490nm 值。每孔加入MTT溶液20y1 (MTT溶液配制：IOOmgMTT粉末溶于20mlPBS里，配成5mg/ ml终浓度溶液。用0. 22ym滤膜过滤W除去溶液里的细菌，EP管分装，-20°C避光保存）。 37°C解育4h后终止培养，小屯、吸弃孔内培养上清液。每孔加入150y1二甲基亚讽DMS0， 振荡10分钟裂解细胞，使沉淀物充分溶解。对照孔操作步骤与此相同。在酶联免疫检测仪 上测定每孔的光密度值（OD值），W空白孔调零。W时间为横轴，0D490值为纵轴绘制细胞 生长曲线。根据化tterson公式PTD=AtXlg2/(lgNt2-lgNtl)计算细胞群体倍增时间。 At为检测的间隔时间，Nt2和Ntl分别表示在细胞对数生长期内，生长曲线上任意两时间 点上的光密度值。结果见图3,表2。
[0054] 表2.MlT生长曲线检测结果及倍增时间
[00 巧]
[0056] 表面标记流式鉴定：取小诞腺上皮干/祖细胞中生长良好、80-90%融合的第3-5 代细胞，消化计数，进行流式抗体标记W进行表面标记鉴定，检测抗体包括：CD29,CD49f， CD166,CK-UT(CK14,15,16,19)。使用0. 25 %膜酶消化细胞，计数，调整细胞浓度为每检测 管lXl〇6/100ul。每种待测抗体设相应同型对照管，每种巧光素设单色巧光补偿对照管。按 说明书浓度加入巧光标记抗体，避光解育30分钟。细胞内标记检测先用2%多聚甲醒固定 后用1 %TritonX-IOO破膜后再加入抗体。350g离屯、5分钟，弃上清，stainingbuffer洗 涂2遍。加入500ulstainingbuffer,混匀。检测前用400目网筛过滤一遍。上机检测。 先测空白对照管，设口，调节电压至阴性区，后测样本管。测定单色巧光补偿对照管，根据结 果调节巧光补偿。结果见表3、图4。
[0057] 表3.流式细胞仪鉴定结果
[0058]
[0059] 免疫巧光检测：小诞腺上皮干/祖细胞接种至Ub-TekTMII腔室载玻片，待细胞 贴壁融合80%后吸去培养基，PBS洗涂2遍，加入4%多聚甲醒固定15分钟，PBS洗涂2遍， 每次5分钟。滴加10%FBS封闭血清，室溫解育1小时。倾去血清，直接滴加一抗，检测一 抗包括K5、K8、CK15、CK18、CK19、AFP、ALB、LGR5及LGR6。滴加PBS者设为空白对照，只加 二抗者设为二抗对照。放入湿盒，4度过夜。次日PBS漂洗3次，每次5分钟。加入巧光标 记二抗，室溫解育30分钟。PBS漂洗3次，每次5分钟。操作中注意避光。滴加Mounting MediumwithDAPI，封片。激光共聚焦显微镜观察：根据二抗设定巧光通道，DAPI选择405nm 通道，AlexaFluor488 选择 488nm通道，CY3 选择 543nm通道，AlexaFluor594 选择 594nm通道。先看空白对照和二抗对照，调整电压，后看样本，拍照保存。巧光显微镜观察：部分标 本为普通巧光显微镜观察拍摄。结果见图5。
[0060] QPCR检测：培养细胞RNA抽提：吸去培养液，加入ImlTrizol,室溫放置5分钟 后反复吹打细胞，将细胞裂解物移入一个1. 5mlEP管。剧烈振荡15秒，加入0. 2倍体积 氯仿，振荡15秒，室溫放置2~3分钟。12000巧m，离屯、10分钟。吸取上层水相，移到 另一新EP管中，加入1. 1倍体积的异丙醇，充分混匀，室溫放置10分钟。12000巧m，离 屯、10分钟，弃去上清液。加入Iml无水乙醇洗涂RNA沉淀。75000rpm，离屯、5分钟，弃去 上清液。充分吸干乙醇残留液，惊干5~10分钟，加入25ulDEPC水溶解RNA沉淀。用 Nano化OP2000测定抽提的RNA浓度和纯度，-80°C保存。反转CDNA:在RNA样品中加入 oligo(dT)isprimerlul。加DEPC水至12ul。65°C解育5分钟后立即放在冰上。按照顺序 加入：4ul5XReactionBuffer、IulRNaseInhibitor(20U/ul)、化1IOmMdNTPMixUul M-MuLVReverseTranscriptase(200U/ul离屯、混合均匀；42°C解育 60 分钟；70°C解育 5 分 钟；合成后的cDNA样品-20°C保存。
[0061] RT-PCR：
[0062] 30yL体积反应体系：
[0063] IOXTaq Buffer with (細。 3uL 2S化 2mM dNTP Mix 3uL 25mM MgCls 2uL IOpM上游弓j物 1.5uL 10 口M下游弓!物 1.5uL Taq DNA 化]ymerase I.抓 cDNA template IMg 补加水至总体积 扎0 30uL
[0064] PCR扩增程序：预变性：94°C，3分钟；变性：94°C，30秒雄火：60°C，1分钟诞伸： 72°C，1分钟；循环数：30个；充分延伸：72°C，5分钟；保存溫度：12°C。
[0065] Real-TimePCR(QPCR)：
[0066] 加入体终浓 成分 浓度 积 度 SYBR Green Realtime 2X 10 ul IX PCR Master Mix 上游引物 10 uM 0.4 ul 0.2 uM 下游引物 IO