结构保存。再与单克隆抗体进行反应，采用间接法ELISA对其进行检 测。通过本实验，不仅可以鉴定抗体对HPV-16 LI VLP、HPV-18 LI VLP和HPV-58 LI VLP三 种VLP的识别情况，还能鉴定该抗体是否是构象型识别抗体。若蛋白质变性后与单抗反应的 0D450值明显降低，则证明该单抗为构象型识别抗体。
[0050] 实验步骤:￥1^变性蛋白处理:0.2 11碳酸钠，0.011101'1'41110.6室温孵育30分钟 后煮沸5分钟。包被:将VLP蛋白稀释至2 μg/ml。以100 yl/孔加至96孔酶标板，4°C包被过 夜。封闭：将包被好酶标板甩干。以300 yl/孔封闭液(2% BSA)加至板内，室温放置1-2小 时。样品稀释：用样品稀释液将抗体样品分别稀释至0.3 μg/ml，混匀，100 yl/孔加至酶标 板内，室温放置1 h。加二抗:将封闭后酶标板甩干，HRP标记羊抗鼠二抗以1:4000浓度，100 yl/孔加至酶标板内，室温放置1 h。显色:每孔300 iil洗板5次，甩干。用卫生纸擦拭底部。以 100 yl/孔加入显色液，室温避光显色10分钟。终止：以100 yl/孔加入终止液，终止反应。读 数:将酶标板放入酶标仪中，0D450进行读数和数据分析。
[0051 ]抗体的特异性检测结果如表3所示。结果表明，克隆1A4与HPV18 VLP有交叉反应， 克隆2F12与HPV16 VLP有交叉反应，其它13株克隆均为HPV58 VLP特异的克隆。所有克隆识 别变性HPV58 VLP的数值均小于0.2，为阴性结果，而这些克隆识别未变性HPV58 VLP的数值 均为阳性，并且大于识别变性HPV58 VLP的数值至少2倍，表明这些单抗均为构象型识别单 抗。
[0052] 表3抗体的特异性ELISA检测(0D450.数值*)
*所有数值均为复孔的平均值 L:未变性蛋白D:变性处理蛋白 实施例6:抗体的中和活性检测 通过假病毒一细胞中和模型，检测各株抗体的中和活性能力。
[0053] 先将各亚型抗体用roS稀释成200ug/ml，然后将抗体进行4倍比梯度稀释，取50ul 各浓度抗体与50ul合适浓度的HPV58假病毒在96孔板中4°C孵育一小时，以假病毒和PBS 的混合液为对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293FT细胞的96孔板中在细胞培养箱 中培养72小时。之后收集细胞，用流式细胞术检测荧光，计算荧光抑制率，荧光抑制率= (1 一实验组/对照组）X 100%。将荧光抑制率大于50%和90%分别作为该单抗对HPV58假 病毒的中和滴度。表4结果表明，所有克隆均有一定的抑制反应，本发明的这些单抗均有中 和活性。
[0054] 表4各亚型抗体的抑制率滴度
实施例7:抗体2F7和抗体2G7的亲和力鉴定 使用BIAC0RE3000 (GE)生物传感器分析了抗原抗体结合及解离的动力学，计算了单克 隆抗体2F7和2G7与HPV58 VLP的结合常数Ka，解离常数Kd和亲和力Kd，以反映该抗体与HPV58 VLP的结合程度的强弱。
[0055]用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液将HPV58 VLP稀释至40 μg/ml，按照制造商的说明 书(BIA⑶RE 3000生物传感器，美国GE公司），将HPV58 VLP偶联制芯片上，设置偶联水平为 4000 RU。
[0056]用PBS缓冲液分别稀释抗体至0 ? 3125，0 ? 625，1 ? 25，2 ? 5，5，10和20 nmol/L。检测 时，先抗体进样60秒，然后结合60秒，解离500秒，最后用10 mM的pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲 液再生芯片。按照制造商的说明书进行抗原抗体结合的动力学分析，并且数据用Biacore 3000 Evaluation软件进行分析。抗体2F7、2G7与HPV58 VLP的亲和力检测结果如表5所示。 结果表明2F7、2G7抗体为特异性的，仅与HPV58 VLP结合，与其它8种HPV VLP均不结合。 [0057] 表5抗体2F7和抗体2G7的亲和力鉴定
aN/A:Not Applicable，表不不结合。
[0058] 实施例8:克隆2F7和克隆2G7的可变区序列测定 将获得的2F7和2G7单克隆细胞分别提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进 行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译 成蛋白质的氨基酸序列。将获得的序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列 为特异的序列。
[0059] 序列见序列表。
[0060]利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例 如嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特 性。
[0061 ] 实施例9 :HPV58检测试剂盒的组装 以具备中和活性的特异性单克隆抗体2G7作为捕获抗体包被酶标板，以具备中和活性 的特异性单克隆抗体2F7经过辣根过氧化物酶标记后作为检测抗体，以重组人乳头瘤病毒-58型VLP蛋白作为标准品配制标准曲线对照。
[0062] 包被抗体2F7用pH 9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成10yg/mL，在酶标板的 每孔加 l〇〇yL，4°C下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤2次，拍干，然后在每孔中加入200yL 3%的小牛血清白蛋白（BSA)，放入37 °C恒温箱中封闭2小时后，用roS洗涤1次，加入10%的蔗 糖水溶液，室温保护1小时，拍干后经干燥后装铝箱袋抽真空后4°C保存。
[0063]用辣根过氧化物酶标记2G7的抗体，得2G7-HRP并保存。向酶标板中分别加入VLP样 品100yL/孔，37°C孵育1.5小时，经洗板后再加入2G7-HRP(0.5ug/ml) 100yL/，37 °C孵育1小 时，经洗涤拍干后加入显色剂进行显色，37°C温育10min，加入终止液50此/孔，用酶标仪 450nm波长进行读数。
[0064]该试剂盒还包括浓缩洗涤液，样品稀释液干粉，酶标抗体稀释液干粉，底物液A，底 物液B和终止液等。其中所述的浓缩洗涤液，底物液A，底物液B，终止液的组分及配比如下： 浓缩洗涤液:Nacl 8.18g，Na2HP04* 12H20 3.58g，KCL 0.2g，KH2P04 0.25g，加双蒸水 至lOOOrnL; 底物液六:3,3'，5'，5-四甲基联苯二胺20011^，无水乙醇1001^，加双蒸水至10001^; 底物液B:Na2HP04 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水 至 lOOOmL，调节 pH至 5 ? 0~5 ? 4; 终止液：lmol/L硫酸溶液。
[0065]实施例10: HPV58检测试剂盒的线性与重复性检测 应用ELISA双抗体夹心法，克隆2F7和克隆2G7抗体做配对实验，确定以克隆2F7为包被 抗体，用HRP标记克隆2G7作为检测抗体，确定了ELISA检测方法，试剂盒检测线性范围如 表6。附图见图2,线性范围为0.1ug/ml - 10ug/ml。
[0066] 表6试剂盒线性范围检测
*所有数值均为复孔的平均值 将抗原依次按照l〇ug/ml、3ug/ml、lug/ml、0 ? 3ug/ml、0 ? lug/ml进行稀释，按照上述 ELASA实验操作步骤进行批间和批内重复性实验。每份样品批内和批间实验都重复检测10 次，并计算标准偏差及变异系数。平均标准偏差为0.256,平均变异系数5.513%，说明本发明 建立的双抗夹心ELASA抗原检测方法具有良好的重复性。
[0067]实施例11: HPV58检测试剂盒特异性试验 用