上述建立的方法进行册￥6、册￥11、册￥16、册￥18、册￥31、册￥33、册￥45、册￥52和册￥58 ￥1^的样品检测，￥1^变性蛋白处理:0.2 11碳酸钠，0.011101'1>1110.6室温孵育30分钟后 煮沸5分钟。96孔板每孔检测30ug /ml VLP lOOul。结果见表8,结果表明，该试剂盒检测未 变性HPV58 VLP信号良好，不识别变性的HPV58 VLP，并且与其它型别HPV VLP无交叉。
[0068] 以上结果表明，试剂盒可以用于特异的检测具有生物活性的HPV58 VLP，因此，可 以广泛应用于HPV58疫苗研发。
[0069] 表7 ELISA法检测HPV58 VLP特异性评价结果(0D450)
*:所有数值均为复孔的平均值 实施例12: HPV58检测试剂盒的测定程序 1、配制样品 1) 洗液配制:取出浓缩洗液，加入蒸馏水，定容至1L充分混匀备用； 2) 样品稀释液配制：用1中所得洗液稀释样稀干粉至50ml，充分混匀备用； 3) 酶标抗体稀释液配制：用1中所得洗液稀释酶稀干粉至50ml，充分混匀备用； 4) 用配制好的样稀稀释标准品，设置稀释梯度。浓度分别为30ug/ml、10ug/ml、3ug/ml、 lug/ml、0 ? 3ug/ml、0 ? lug/ml、0 ? 03ug/ml，备用。
[0070] 5)用配制好的酶稀稀释酶标抗体，取适量酶标抗体1300倍稀释，备用。
[0071] 2、测定步骤 1)加样:将配制好的标准品及待测样品加入包被板内，lOOul/well，同时设置复孔及阴 性对照孔。（阴性对照空为样品稀释液)盖上封板膜放入37°C温箱孵育45min。
[0072] 2)加酶标抗体:将酶标板从37 °C温箱取出，弃去孔内液体，加入洗液300ul/wel 1， 洗板5次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。加入配制好的酶标抗体溶液lOOul/ well，盖上盖板膜放入37°C温箱孵育45min。
[0073] 3)显色：将酶标板从37°C温箱取出，弃去孔内液体，加入洗液300ul/well，洗板10 次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。取所需体积的显色底物A液与显色底物B液 按照1:1的比例混匀，lOOul/well加入酶标板中，室温避光显色5分钟。
[0074] 4)终止反应:取所需体积终止液加入酶标板中，50ul/well。
[0075] 5)读值:将酶标板放入酶标仪中，0D450nm进行读数。
[0076] 6)结果判定：Cutoff值=2.1 XNC均值，高于此数值的样品检测结果判定为阳性。
[0077] 实施例13: HPV58检测试剂盒的应用 取标准品HPV58 VLP蛋白进行梯度稀释，采用本发明制备的双抗体夹心ELISA抗原检测 试剂盒对稀释后的样品HPV58、HPV58、HPV58的LI 10μg/ml五聚体抗原进行检测，借以评价 该试剂盒的初步应用效果。结果显示，本发明所建立的ELISA方法可以检测到HPV58五聚体 蛋白，并具有特异性。
[0078] 表8 ELISA法检测HPV58五聚体特异性评价结果(0D450)
【主权项】
1. 一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由杂交 瘤细胞株2F7产生，其CGMCC保藏号为11295。2. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含至少1个抗体重链可变区 和至少1个抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和 CDRL3,其中： CDRL1 包括SEQ ID N0:1; CDRL2包括SEQ ID N0:2; CDRL3包括SEQ ID N0:3。3. 如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于其中所述抗体重链可变区具有选自 CDRH1、CDRH2或/和CDRH3，其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:4; CDRH2包括SEQ ID N0:5; CDRH3包括SEQ ID N0:6。4. 一种识别人乳头瘤病毒58型LI蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于其中 包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQ ID N0:7和至少1个抗体重链可变区包括SEQ ID NO: 8〇5. -种分离的核酸，其特征在于所述核酸编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQ ID NO:7和重链可变区SEQ ID NO:8。6. -种包括权利要求5所述核酸的表达载体，其特征在于载体转染宿主细胞时所述核 酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。7. -种包括权利要求6表达载体的宿主细胞。8. -种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由杂交 瘤细胞株2G7产生，其CGMCC保藏号为11296。9. 如权利要求8所述的单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含至少1个抗体重链可变区 和至少1个抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和 CDRL3,其中： CDRL1 包括SEQ ID N0:9; CDRL2包括SEQ ID N0:10; CDRL3包括SEQ ID N0:11。10. 如权利要求9所述的单克隆抗体，其特征在于其中所述抗体重链可变区具有选自 CDRH1、CDRH2或/和CDRH3，其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:12; CDRH2包括SEQ ID N0:13; CDRH3包括SEQ ID N0:14。11. 一种识别人乳头瘤病毒58型LI蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于其 中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQ ID NO: 15和至少1个抗体重链可变区包括SEQ ID N0：16〇12. -种分离的核酸，其特征在于所述核酸编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQ ID NO: 15和重链可变区SEQ ID NO: 16。13. -种包括权利要求12所述核酸的表达载体，其特征在于载体转染宿主细胞时所述 核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。14. 一种包括权利要求13表达载体的宿主细胞。15. -种检测HPV58 L1的试剂盒，其包括任一权利要求1-4和/或任一权利要求8-11所 述的单克隆抗体或抗原结合片段。16. 如权利要求15所述的检测HPV58 L1的试剂盒，还包括可检测的标记:放射性同位 素、荧光物质、发光物质、有色物质和/或酶。17. -种特异性检测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的组合物，其特征在于该组合物包含任 一权利要求1-4和/或任一权利要求8-11所述的单克隆抗体或抗原结合片段。18. 如权利要求15或16所述试剂盒在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测 组合物中的应用。19. 如权利要求17所述组合物在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测组合 物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了人乳头瘤病毒58型（HPV58）特异性的单克隆抗体。本发明提供的特异性单克隆抗体与其它型别HPV无明显交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测疫苗种中HPV58型有生物活性疫苗的含量，在临床检测和疫苗生产过程中将会得到广泛应用。CGMCC No.1129520151030
【IPC分类】G01N33/577, C12N15/13, G01N33/569, C07K16/08
【公开号】CN105713087
【申请号】CN201510771139
【发明人】陈健平, 张海江, 潘勇昭, 何野, 任冬妍, 张尧, 刘永江, 夏丽
【申请人】北京康乐卫士生物技术股份有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2015年11月12日