一种用于pcr扩增的丝状真菌dna的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]土壤丝状真菌广泛存在于自然界中，在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用，多年来一直被广泛的研究。由于真菌细胞壁成分复杂，难以得到充分裂解，真菌中富含的多糖、色素、核酸酶等物质使得核酸的分离更加困难，因此真菌破壁效率和效果直接影响到真菌DNA提取的效率和效果。已报道的真菌破壁方法有:液氮冷融(ManianS，Sreenivasaprasad S，Mills P R.DNA extract1n method for PCR in mycorrhizalfungi [J].Lett Appl Mierob1l，2001，33 (4):307-310.)、-70 °C 冻融(Griffin D W，Kelogg C A，Peal K K，et al.A rapid and eficientassay for extract1n DNA fromfungi[J].Lett Appl Micmb1l，2002，34(3):210-214.)、酶消解(Williamson E C，Leeming J P，Palmer Η M，et al.Diagnosis of invasive aspergillosis in bonemarrow transplant recipient by polymerase chain react1n[J].Br J Haematol，2000，108(1):132—139)、超生破碎(Haugland R A，Heckman J L，ffymer L J.Evaluat1n ofdifferent methods for the extract1n of DNA from fungal conidia by quantitativecompetitive PCR analysis [J].J Miereb1l Methods，1999，37 (2):165—176.)、高盐溶液(Danilevich V N，Grishin E V.A new approach to the isolat1n of genomic DNAfrom yeast and fung1-preparat1n of DNA—containing cell envelopes and theiruse in PCR[J].Bicor Khim，2002，28 (2):156-167.)、尿素缓冲液处理(SansinforianoΜ E，Padilla J A，Hermoso de Mendoza J，at al.Rapid and easy method to extractand preserve DNA from Cryptococeus neoformans And other pathogenic yeasts[J].Mycoses,1998，41(5-6):195-198) o
[0003]现有的方法步骤较为繁杂，所需试剂较多，需要较高的时间成本和经济成本，不能满足高通量的要求，因此，需要简化操作步骤，以便提高工作效率。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法，旨在解决现有的方法步骤较为繁杂，所需试剂较多，需要较高的时间成本和经济成本，不能满足高通量的要求的问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法，所述用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法包括:
[0006]菌种培养，将所筛选的菌种接种在PDA液体培养基中，28°C震荡培养48h ;
[0007]吸取1ml菌液到无菌EP管中，常温下10000r/min离心5min ；
[0008]弃去上清液，将沉淀重悬于0.8ml生理盐水中8000r/min离心5min ；
[0009]弃去上清液，向EP管内加入6000 μ L2 X CTAB提取缓冲液混合，再加入lg玻璃珠，于振荡器上震荡lOmin ;
[0010]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0011 ] 加6000 μ L的氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下lOOOOr离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0012]移取上清液至Eppendorf管中，加等体积的氯仿/异戊醇混合液，常温下lOOOOr离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0013]取上清液，加入6000 μ L冰冻乙醇，静置30min ；
[0014]常温下10000r/min 离心 lOmin ；
[0015]弃上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L ΤΕ缓冲液充分溶解后在-20°C下保存备用。
[0016]进一步，所述2XCTAB提取缓冲液含0.7mol/L NaCL, 100mmol/L Tris-HCL ρΗ8.0，20mmol/L EDTA，20g/L CTAB。
[0017]进一步，所述TE 缓冲液含 lOmmol/L Tris-HCl lmmol/LEDTA pH 8.0o
[0018]本发明的另一目的在于提供一种使用所述用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法的紫薇内生真菌DNA的提取方法，所述紫薇内生真菌DNA的提取方法包括:
[0019]菌种培养:将所筛选的紫薇内生真菌接种在PDA液体培养基中，28°C震荡培养48h ；
[0020]吸取1ml菌液到无菌EP管中，常温下10000r/min离心5min ；
[0021]弃去上清液，将沉淀重悬于0.8ml生理盐水中8000r/min离心5min ；
[0022]弃去上清液，向EP管内加入6000 μ L2XCTAB提取缓冲液混合，再加入lg玻璃珠，于振荡器上震荡lOmin ;
[0023]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0024]加6000 μ L氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下lOOOOr离心5min ;氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0025]移取上清液至Eppendorf管中，加等体积的氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下10000r离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0026]取上清液，加入6000 μ L冰冻乙醇，静置30min ；
[0027]常温下10000r/min 离心 lOmin ；
[0028]弃上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L TE缓冲液溶解后在_20°C下保存备用。
[0029]本发明的另一目的在于提供一种使用所述用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法的白酒丝状真菌DNA的提取方法，所述白酒丝状真菌DNA的提取方法包括:
[0030]菌种培养:将所筛选的白酒丝状真菌接种在PDA液体培养基中，28°C震荡培养48h ；
[0031]吸取1ml菌液到无菌EP管中，常温下10000r/min离心5min ；
[0032]弃去上清液，将沉淀重悬于0.8ml生理盐水中8000r/min离心5min ；
[0033]弃去上清液，向EP管内加入6000 μ L2XCTAB提取缓冲液混合，再加入lg玻璃珠，于振荡器上震荡lOmin ;
[0034]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0035]加6000 μ L氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下lOOOOr离心5min ;氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0036]移取上清液至Eppendorf管中，加等体积的的氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下10000r离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0037]取上清液，加入6000 μ L冰冻乙醇，静置30min ；
[0038]常温下10000r/min 离心 lOmin ；
[0039]弃上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L TE缓冲液溶解后在_20°C下保存备用。
[0040]本发明的另一目的在于提供一种使用所述用于PCR扩增的丝状真菌DNA的提取方法的泡菜丝状真菌DNA的提取方法，所述泡菜丝状真菌DNA的提取方法包括:
[0041]菌种培养:将所筛选的泡菜丝状真菌接种在PDA液体培养基中，28°C震荡培养48h ；
[0042]吸取1ml菌液到无菌EP管中，常温下10000r/min离心5min ；
[0043]弃去上清液，将沉淀重悬于0.8ml生理盐水中8000r/min离心5min ；
[0044]弃去上清液，向EP管内加入6000 μ L2 X CTAB提取缓冲液混合，再加入lg玻璃珠，于振荡器上震荡lOmin ;
[0045]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0046]加6000 μ L氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下lOOOOr离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0047]移取上清液至Eppendorf管中，加等体积的的氯仿/异戊醇混合液摇匀，常温下10000r离心5min，氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1 ;
[0048]取上清液，加入6000 μ L冰冻乙醇，静置30min ；
[0049]常温下10000r/min 离心 lOmin ；
[00