Dna标签、pcr引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸测序及分型技术领域，具体地，涉及DNA标签、PCR引物及其应用， 更具体地，涉及一组DNA标签、一组PCR引物、一组标签PCR引物、构建核酸测序文库的方 法、确定DNA样品预定STR基因座基因型的方法、用于构建核酸测序文库的试剂盒以及确定 DNA样品预定STR基因座基因型的系统。
【背景技术】
[0002] STR基因座序列又称短串联重复序列（Short tandem r印eat)是人类基因组中一 类广泛分布的遗传标记，通常由2-7个核心碱基构成，其重复单位数目不同导致不同个体 同一基因座中存在不同的等位基因。其等位基因类型可用银染、荧光标记和放射自显影等 技术进行分型。STR基因座具有如下特点：（1)在人类基因组中分布广泛；（2)片段一般小 于400bp，易于扩增；（3)检测的灵敏度比小卫星VNTR基因座高十倍，适用于微量检材的鉴 定；（4)同一 STR基因座的不同等位基因之间片段长度差别不大，优势扩增不明显；（5)不 同STR基因座之间片段长度差别不大，扩增条件相似，可设计在同一反应体系中进行复合 扩增，降低成本和器材消耗，提高效率。
[0003] 目前对STR通用的检测方法是以多重PCR检测约16个STR基因座的基因型，在检 测中使用以多色荧光标记的引物对样品进行多重PCR扩增，使所产生具有荧光标记的针对 每个基因座的不同大小的扩增片段在毛细管电泳中分离，并与标准物进行比对，从而实现 对每个基因座中的等位基因进行分型。但是，这种方法由于技术上的限制，也存在着一定 的缺陷，主要有：（1)由于荧光标记物的相互干扰和毛细管长度及成像技术等方面的限制， 被分析STR基因座的数目已难以进一步大幅提升；(2)由于分析的对象是各个片段的长度 大小，无法进一步检测到组成片段的核酸一级结构的微小差异，因此限制了检测的分辨度；
[3] 存在无效等位基因，致使不同的试剂盒有可能出现某些基因座测定结果的差异；(4) Stutter峰（片段分析中时而出现于主峰前的小峰）的干扰，尤其是存在混合样品时；（5) Sanger法来进行STR分型，由于通量、成本等原因，特别不利于STR分型数据库的构建。
[0004] 因而，目前的STR基因座的检测分型方法仍有待改进。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够快速高效地对DNA样品尤其是多个DNA样品进行预定STR基因座的检测 分型的方法。
[0006] 具体地，本发明通过自主设计的一组STR分型引物以及一组DNA标签，对不同个体 基因组进行多重PCR扩增后，再经过高通量测序分析，得到不同个体之间的STR分型，进而 达到身份鉴定的目的。该方法可以解决目前STR分型方法中的困扰，提高基因分型的解析 度。
[0007] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一组DNA标签。根据本发明实施例的 一组DNA标签，其选自SEQ ID NO :1-95所示的核苷酸。本发明的一组DNA标签能够用于构 建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签（在本文中有时也 称为"核酸标签"），通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来 源。由此，利用上述DNA标签，可以同时构建多种DNA样品的用于测序的核酸测序文库（在 本文中，有时也称为DNA标签文库），从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行 混合，同时进行测序，基于DNA标签对获得的测序序列进行分类，获得多种DNA样品的序列 信息。从而可以充分利用1?通量的测序技术，例如利用Solexa、SOLID、单分子和454测序 平台的至少一种，同时对多种DNA样品进行测序，从而提高STR检测的效率和通量。
[0008] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一组PCR引物。根据本发明实施例的 一组PCR引物，其选自SEQ ID NO :96-135所示的核苷酸。本发明的一组PCR引物分别与 预定 STR 基因座 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、 D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E 和Amelogenin特异相关，利用该组PCR引物将DNA样品进行多重PCR扩增，能够一步多重 PCR扩增20个STR基因座，经过测序即可快速获取其DNA序列，STR检测通量高，STR位点 分辨能力和灵敏度好。
[0009] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一组标签PCR引物。根据本发明实施例 的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述 的一组PCR引物的5'末端而获得的。因而，本发明的一组标签PCR引物，可以有95种形式， 进而利用本发明的一组标签PCR引物可以一次对95种DNA样品进行上述20个STR基因座 的基因型检测。
[0010] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括以下步骤：将DNA样品进行多重PCR扩增，以便获得PCR扩增产 物，其中所述多重PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；以及纯化回收所述PCR 扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本发 明实施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品预定STR基因座基因 型的核酸测序文库中，从而可以通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品预定STR基因 座的序列信息以及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品预定STR基因座的序列 信息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的预定STR基因座的 序列信息，以及其基因型，提高了 STR检测的通量、效率和准确度。
[0011] 根据本发明的实施例，所述构建核酸测序文库的方法进一步包括：将所述核酸测 序文库依次进行末端修复、3'末端添加碱基A、连接测序接头以及纯化回收连接产物的步 骤。
[0012] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定DNA样品预定STR基因座基因 型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建核酸测序文库 的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，以便确定所述 DNA样品预定STR基因座的序列信息；以及基于所述DNA样品预定STR基因座的序列信息， 确定所述DNA样品的预定STR基因座基因型。基于该方法，能够有效地获得DNA样品预定 STR基因座的序列信息及其基因型。
[0013] 根据本发明的实施例，利用Solexa、SOLID、单分子和454测序平台的至少一种对 所述核酸测序文库进行测序。由此，测序通量高，STR检测结果准确可靠。
[0014] 根据本发明实施例，所述预定STR基因座为D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、 D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA、 D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E 和 Amelogenin 的至少一种。
[0015] 根据本发明实施例，所述DNA样品为多种，所述多种为2-95种，所述方法包括以下 步骤：针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的方法构建所述DNA样品 的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签；将所述多种DNA样品的 核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物；对所述核酸测序文库混合物进行 测序，以便获得所述DNA样品预定STR基因座的序列信息以及所述DNA标签的序列信息；基 于所述DNA标签的序列信息对所述DNA样品预定STR基因座的序列信息进行分类，以便确 定所述多种DNA样品的预定STR基因座的序列信息；以及基于所述多种DNA样品的预定STR 基因座的序列信息，分别确定所述多种DNA样品的预定STR基因座基因型。由此，能够同时 构建多种DNA样品的用于确定预定STR基因座基因型的核酸测序文库，从而可以通过将来 源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对DNA样品预定STR 基因座的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的预定STR基因座的序列信息。从而可以 充分利用高通量的测序技术，例如利用S〇lexa、S0LID、单分子和454测序平台的至少一种， 同时对多种DNA样品进行测序和STR检测，从而提高了 STR检测的效率和通量。
[0016] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品预定STR基因座 基因型的试剂盒。根据本发明实施例的试剂盒，其包括：一组DNA标签，所述DNA标签选自 SEQ ID NO :1-95所示的核苷酸；以及一组PCR引物，所述PCR引物选自SEQ ID NO :96-135 所示的核苷酸。由此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标 签PCR引物，进而利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品预定STR基因座基因 型的方法，一次性最多能够实现95种DNA样品的STR检测。
[0017] 根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于确定DNA样品预定STR基因座基 因型的试剂盒。根据本发明实施例，所述试剂盒设置有前面所述的一组标签PCR引物。由 此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样 品预定STR基因座基因型的方法，一次性最多能够实现95种DNA样品的STR检测。
[0018] 根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种确定DNA样品预定STR基因座基因 型的系统。根据本发明实施例，其包括：文库构建装置，所述文库构建装置用于根据前面所 述的方法构建