一种利用离子束诱变获得花生突变体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用离子束诱变获得花生突变体的方 法。
【背景技术】
[0002] 离子束诱变作为一种物理诱变方法，与传统的物理诱变相比，具有生理损伤小、突 变谱广、突变频率高，并有重复性和方向性的优点，是作物诱变的一种方法。
[0003] 花生优异种质资源贫乏，对花生育种工作造成了较大的约束。理化诱变可以产生 突变体，已成为构建突变体的一种有效方法；传统的物理诱变也可以产生诱变，但存在Ml 代存活率低、M2代突变谱窄、无方向性和育种效率低等缺点，离子束诱变弥补了这些缺点。
[0004] 上世纪20年代，Muller发现X射线可以引起生物遗传物质的变异，之后 Tollernear利用X射线育成了第一个烟草突变品种，并得到推广应用。随着射线诱变技术 的快速发展和应用，日、美、法、德等拥有大型加速器的国家在20世纪60年代相继开始了高 能重离子注入的生物学诱变技术研究。随后，1986年中国科学家余曾亮率先将低能离子束 应用于植物诱变遗传育种技术。开创了具有中国自主知识产权的原创新技术一一低能离子 束物理诱变技术，并领先于国际。1995年，离子束介导大分子DNA转移的优势被美国《遗传 工程新闻》第1期列为当前国际生物技术研究的热点之一，引起国内外关注。在中国国内已 有多家高校、科研院所和育种单位开展了离子束作物育种研究，培育出了一批优良作物新 品种和有价值的育种新材料。
[0005] 离子束注入作为一种新兴的辐射诱变源，具有传能线密度高突变率高、突变谱广、 重复性好的特点，该方法的主要设备是离子注入机，在较高的真空条件下，由高压加速的 气体离子轰击目标材料，使之产生突变，极大地增加了生物基因的突变几率。目前，这种方 法已经在拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等作物中构建了突变体库，并在遗传改良和 功能基因组系研究中发挥了重要作用。但是现有技术中还未公开一种行之有效的获得花生 突变体的方法。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提出一种利用离子束诱变获得花 生突变体的方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0008] -种利用离子束诱变获得花生突变体的方法，至少包括以下步骤：
[0009] 第一步：将不同剂量的离子束分别照射不同品种的花生种胚中，同时以相应品种 的、未经照射处理的花生种胚作为对照；
[0010] 第二步：将经过离子束照射的不同品种的花生种胚进行水培发芽实验，得出发芽 势及发芽率；并将Ml代进行田间播种，观察出苗情况，并得到出苗率及相对出苗率；Ml代收 获后采用一粒传法，将M2代按照不同品种及不同剂量处理播种，获得M3代花生种子；在本 步骤中均设有未经离子束照射的相应品种的花生种胚作为对照；
[0011] 第三步：对获得的M3代花生种子中，对于不同品种的诱变群体中选取相同数量的 田间地上部分植株，分单株收获，晾晒后进行脂肪含量及脂肪酸含量的测定获得突变体。
[0012] 所述的技术方案优选为，在第一步中，不同品种的花生种胚的数量相等。
[0013] 所述的技术方案优选为，在第二步中，将Ml代中表型变异的单株按株系种植，在 生育期内记录株高、株型、叶型、荚果、花的性状，筛选不同类型的表型突变体，按单株收获。
[0014] 进一步地，将筛选的表型突变体种植成株系，并进行跟踪观测，对突变表型的稳定 性进行观察。
[0015] 所述的技术方案优选为，在第二步中，所述发芽势的计算方法为：
[0016] 发芽势（％)=第三天发芽的种子数/总种子数X100% ;
[0017] 所述发芽率的计算方法为：发芽率（％)=第六天发芽的种子数/总种子 数X100%;
[0018] 所述出苗率的计算方法为：出苗率（％)=出苗数/播种的种子数X100% ;
[0019] 所述相对出苗率的计算方法为：相对出苗率=出苗率/对照的出苗率X100% ;
[0020] 所述果/花率的计算方法为：果/花率（％)=收获荚果数/注射花朵数X100%;
[0021 ] 所述仁/花率的计算方法为：仁/花率（％ )=收获籽仁数/注射花朵数X100 %。
[0022] 所述的技术方案优选为，在第三步中，所述脂肪含量采用索氏提取法测定。
[0023] 所述的技术方案优选为，在第三步中，所述脂肪酸含量采用气相色谱法测定。
[0024] 与现有技术相比，本发明所述的优越效果在于：采用离子束诱变方式，经离子束照 射诱变处理的不同品种的花生种胚，并与对照品种进行比较。经过大量实验数据研究表明， 离子束使花生产生矮杆突变、多分枝突变、丛生株突变、花异常突变、大叶突变、荚果突变、 大粒突变体以及不育株，但是在不同的品种间效果不同。这些突变体极大地丰富了花生种 质资源，对花生育种具有很好的实践上的应用。突变的花生在不同的生长发育阶段会表现 出不同于正常植株的性状，这些性状足以使人们判断该植株是否为突变体，有利于花生育 种的选择鉴定。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0026] 本发明以河南农业大学花生新品种416和606为试验材料。花生416为珍珠豆型， 果仁多为圆形或桃形，连续开花习性，株型直立，含油量为48. 22%;花生606为普通型，果 仁多为椭圆形或长椭圆形，连续开花习性，株型直立，含油量为57. 81 %。试验材料播种于河 南农业大学科教园区，地力、肥力均匀，常规栽培管理。
[0027] 本发明所述一种利用离子束诱变获得花生突变体的方法，包括以下步骤：
[0028] 第一步：将不同剂量的离子束分别照射花生416、花生606两个品种的花生种 胚中，所述两种花生种胚的数量相等；同时以相应品种的、未经照射处理的花生种胚作 为对照，其中对照组标识为CK。进一步地，所述离子束的剂量分别为：2X107i〇nS/cm2、 3X107ions/cm2、4X107ions/cm2、5X107ions/cm2、6X107ions/cm2、7X107ions/cm2〇
[0029] 第二步：将经过离子束照射的不同品种的花生种胚进行水培发芽实验，得出发芽 势及发芽率；并将Ml代进行田间播种，观察出苗情况，并得到出苗率及相对出苗率；Ml代收 获后采用一粒传法，将M2代按照不同品种及不同剂量处理播种，获得M3代花生种子；在本 步骤中均设有未经离子束照射的相应品种的花生种胚作为对照。
[0030] 进一步地，将Ml代中表型变异的单株按株系种植，在生育期内记录株高、株型、叶 型、荚果、花的性状，筛选不同类型的表型突变体，按单株收获；同时将筛选的表型突变体种 植成株系，并进行跟踪观测，对突变表型的稳定性进行观察。
[0031] 在本步骤中，所述发芽势的计算方法为：发芽势（％)=第三天发芽的种子数/总 种子数X100% ;
[0032] 所述发芽率的计算方法为：发芽率（％)=第六天发芽的种子数/总种子 数X100% ;
[0033] 所述出苗率的计算方法为：出苗率（％)=出苗数/播种的种子数X100% ;
[0034] 所述相对出苗率的计算方法为：相对出苗率=出苗率/对照的出苗率X100% ;
[0035] 所述果/花率的计算方法为：果/花率（％)=收获荚果数/注射花朵数X100%;
[0036] 所述仁/花率的计算方法为：仁/花率（％ )=收获籽仁数/注射花朵数X100 %。
[0037] 本发明中所述的发芽势、发芽率如表1所示。
[0038] 表1不同剂量N+离子注入后不同花生品种（系）Mi代发芽势及其发芽率
[0039]
[0040] 表1中，小写字母表示5%水平上显著，大写字母表示1 %水平上极显著。
[0041] 由表1可知，随着N+离子束注入剂量的增加，花生416和花生606两品种的发芽 势变化趋势一致，均呈现出先升高后降低的马鞍型曲线。经离子注入后的花生种子，剂量 为4X107ionS/cm2时，其发芽势与对照发芽势相比差异不显著，其他剂量处理均极显著低 于对照。花生416品种各处理间发芽势差异极显著，花生606品种在3X107ions/cm2和 4X107ionS/cm2两处理之间差异不显著，其他处理间发芽势差异均达极显著水平。在各 处理中，两个品种都在离子注入剂量为4X107ions/cm2时，种子的发芽势最高；剂量高于 5X107ions/cm2时，种子发芽势极显著降低。花生416和606两品种均在剂量为7X10 7ions/ cm2处理时其发芽率接近其半致死剂量。
[0042] 本发明所述花生416和花生606两品种经离子注入后，由于花生种胚受诱变辐射 的机械损伤和生理损伤，经田间调查发现，在生育期内长势与对照相比，Ml代表现为植株明 显矮小，分枝少，贪青晚熟，结荚少，在M2代这些表型变化能够恢复。
[0043] 在M2代群体表型变异是评价突变体库的重要指标，因为M2代消除了Ml代机械损 伤带来的表型变化。经离子束诱变后，花生416和606两品种的M2代分别产生了多种类型 的突变植株，主要表现在株高、生育期、荚果、分枝、育性等性状，发生表型突变的频率约为 7. 63%。由表2可知，花生416和606两品种均在4X 107ions/cm2剂量时变异类型最丰富， 7X107ionS/cm2剂量产生株高和不育株变异最丰富。具体表现如下：
[0044] (1)株高突变体
[0045] 花生416品种的株高为32~35cm，花生606品种的株高为41~45cm，花生416 品种高杆株高平均值为38. 6cm，矮杆株高平均值为25. 2cm;花生6