一种以农作物秸秆为主体的白腐真菌培养基及其配制方法与流程

本发明属于农作物秸秆资源化利用
技术领域：
，具体地涉及一种以农作物秸秆为主体的白腐真菌培养基及其配制方法。
背景技术：
：我国是农业大国，每年有大量的农作物秸秆废弃物的产生，这些秸秆中含有大量可用作饲料和造纸原料的纤维素和半纤维素。在植物组织中木质素与半纤维素以共价键的形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物很难降解利用，制约了农作物秸秆的资源化利用。白腐菌作为自然界中迄今为止最有效、最主要的可降解木质纤维素的真菌类微生物，可彻底降解木质纤维素为CO2和H20。木质纤维素降解真菌可分为3类：白腐菌(Whiterotfungi)、褐腐菌(Brownrotfungi)和软腐菌(Softrotfungi)。气质褐腐菌只能攻击和降解细胞壁中的纤维素、半纤维素部分，而软腐菌仅作用于细胞中的半纤维素，只有白腐菌是自然界中唯一一类具有独立降解木质素能力的微生物，褐腐菌、软腐菌一般认为在木质素降解中仅起二次作用。白腐菌分泌木质素降解酶的同时还分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类，因而比木霉、曲霉等更适合分解天然的木质纤维素物质。纤维素是植物细胞壁的主要成分，广泛存在于自然界，是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，也是人类未来可能的能源、食品和化工原料的主要来源。利用纤维素酶将纤维素转化为可利用的糖，对于可持续发展战略的实施具有重大意义。因此首先要降解木质素，才能最大限度利用纤维素。木质纤维素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子化合物。木质纤维素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。如何高效利用木质纤维素原料其关键在于有效降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积，使纤维素易于降解，从而生成可发酵性糖，以及应用于生物制浆过程中。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种以农作物秸秆为主体的白腐真菌培养基，并提供其制备方法。为达到上述目的，本发明的技术方案是：本发明一种半固体培养基，培养基按重量组分包括以下组分：秸秆56-75份麸皮20-40份(NH4)2SO41份KH2PO40.5份葡萄糖2.5份上述组分的总和为100份。优选的，所述培养基的固液比为1∶4.5～1:6.5。(固液比为培养基中固态物质与水质量比)优选的，所述培养基的pH值为6.9-7.2。优选的，所述半固体培养基，培养基按重量组分包括以下组分：秸秆60-73份麸皮23-36份(NH4)2SO41份KH2PO40.5份葡萄糖2.5份上述组分的总和为100份。所述的真菌为白腐真菌，用于降解利用秸秆中木质素。所述培养基的制备方法为：(1)预处理：用粉碎机将已剥净粗皮的秸秆粉碎过筛，筛子的大小为80-100目；(2)将上述组分按照所述配比充分混合；(3)根据固液比加入一定量水后，调节pH值为6.9-7.2即可使用。所述农作物秸秆为常见秸秆：稻草秸秆、麦草秸秆和玉米秸秆。更优选的，所述秸秆为麦草秸秆。本发明还提供所述培养基的的用途，用于白腐菌的培养基。优选的，所述培养基的的用途，将制作完毕的培养基，在无菌条件下接种白腐菌，并放入恒温生物培养箱中，设定温度32～37℃，转速70～90rpm。更优选的，转速为80rpm。本发明中所应用的白腐菌为：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)本发明所涉及的白腐菌的培养基，可在保证白腐菌生长过程所需养分的供给的同时优化培养工艺，缩短培养周期，降低生产成本以及有利于推广白腐菌生物预处理农作物秸秆资源化和工业化的利用。本发明的有益效果一：本发明按照菌种的生长需求，提供一种营养均衡、利于菌种生产、价格低廉的真菌培养基；本发明的有益效果二：本发明所涉及的白腐菌的培养基的制备，可在保证白腐菌生长过程所需养分的供给的同时优化培养工艺，缩短培养周期，降低生产成本，有利于推广白腐菌生物预处理农作物秸秆工业化的利用本发明的有益效果三：本发明所提供的培养基以农作物秸秆为主体，利用白腐菌对木质素的选择降解性，提高了农作物秸秆的资源化利用价值，为秸秆废弃物的在饲料和生物制浆方面的应用提供可能。附图说明图1为麦草两种培养基降解30d木质素降解率对比图(PSD为本发明所提供的培养基；PSC为传统液体培养基)图2为玉米两种培养基降解30d菌丝生长状况对比图(PSD为本发明所提供的培养基；PSC为传统液体培养基)具体实施方式实施例1：一种含小麦秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)培养基包括以下重量份的组分：麦草秸秆73g，(NH4)2SO41g，葡萄糖2.5g，麸皮23g，KH2PO40.5g，固液比1:4.5制备方法为：将麦草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为7.2，即可使用。培养过程中，培养基置于32℃恒温培养箱中，转速80rpm。在无菌条件下，取出经过一段时间培养的培养基5g,真空冷冻干燥8h，既可按照Klason法测定基质中木质素含量，与培养前含量进行对比既可得到培养过程中木质素降解率。实验结果见图1。实验证明，通过测定培养前后基质中木质素含量可以得知，本发明所提供的培养基可高效培养黄孢原毛平革菌并选择性降解机制中木质素，同时菌丝长势要比传统固体培养基的长势粗壮的多，而且菌丝的生长速度提前3-5天。实施例2：一种含稻草秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)半固体培养基包括以下重量份的组分：稻草秸秆60g(NH4)2SO41g葡萄糖2.5g麸皮36gKH2PO40.5g固液比1:5.5制备方法为：将稻草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为6.9，即可使用。培养过程中，培养基置于37℃恒温培养箱中，转速80rpm。培养过程中测定黄孢原毛平革菌培养过程产酶特性。具体实施方式：(1)粗酶液的制定无菌条件下，将第一个十天保温箱内摇床内的稻草秸秆的PSC(传统液体培养基)、PSD(本发明所提供的半固体培养基)培养基各取出一个，准备六个小烧杯，六个培养皿，将每个培养基平均划分成两半，其中一半连同另一半表面上的菌转移到小烧杯中，加入40ml蒸馏水，室温下浸提4h，用4层纱布过滤后10000rpm/min离心10min，上清液即为粗酶液，置4℃冰箱备用。另一半转移到培养皿中铺平，用保鲜膜将培养皿包好，扎若干小孔，放入-20℃冰箱中备用。(2)酶活性的测定黄孢原毛平革菌能够产生胞外氧化酶来降解秸秆中的木质素，其主要包括锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、漆酶(Lac)。在此以锰过氧化物酶为例进行说明。MnP取50mmol/L的乳酸钠缓冲液(pH4.5)3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4溶液0.1mL，0.4mL的粗酶液预热至37℃加入1.6mmol/L的过氧化氢溶液0.1mL启动反应。测定最初3min内240nm处吸光度，1个酶活力单位用min-1·g-1粗酶液增加0.1OD来表示。表1黄孢原毛平革菌在不同培养基上Mnp酶活性活动变化(U/mL)Table4PhanerochaetechrysosporiumMnpactivitychangesofactivity(U/mL)ondifferentmedia从表1中可以分析得到，在培养后的5-10d时，开始表现出Mnp活性，并在不同培养基中均呈现升高-降低的趋势，在培养的第15d达到高峰，稻草的PSC和PSD酶活高达49.70U/mL和51.81U/mL。此后酶活性均出现下降趋势。实验证明，本发明所提供的半固体真菌培养基在培养过程中与传统固体培养基相比，相同培养时间内锰过氧化物酶的产率明显提高，说明其对基质中木质素选择降解性更好，黄孢原毛平革菌生长更加旺盛，生物量更加丰富。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势一样浓密、粗壮，而且菌丝的生长速度略有提前。实施例3一种含玉米秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)培养基包括以下重量份的组分：玉米秸秆65g(NH4)2SO41g葡萄糖2.5g麸皮31gKH2PO40.5g固液比1:6.5制备方法为：将麦草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为7.0，即可使用。培养过程中，培养基置于32℃恒温培养箱中，转速80rpm。在无菌条件下，取出经过一段时间培养的玉米秸秆的PSC(传统液体培养基)、PSD(本发明所提供的培养基)培养基5g移入同样组分的菌包培养基中，置于32℃恒温培养箱中连续培养30天。每隔5天记录菌丝生长状况，使用记号笔标出菌丝覆盖位置，30天后以菌丝覆盖菌包表面面积变化值计数。实验结果见图2。实验证明，通过对比PSC与PSD两种不同培养基菌丝净生长速度可以得知，本发明所提供的培养基PSD菌丝净生长速度要快传统培养基PSC，并在第15天达到最大生长速度，在30天时达到最大生长面积。实验证明本发明所提供的培养基中，黄孢原毛平革菌生长更加旺盛，生物量更加丰富。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势浓密、粗壮，菌丝的生长速度提前3-5天提前。当前第1页1 2 3