一株寄生曲霉及其制备方法和应用与流程

本发明属于害虫生物防治技术领域，涉及一株寄生曲霉及其制备方法及应用。

背景技术：

自发明化学农药之后，化学农药以每年5%惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业作为增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的抗药性、农药残留等一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。同时化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。随着无公害农产品需求的日益增长和市场的良性发展，应用微生物杀虫剂防治害虫的呼声越来越高，因此亟需研究开发新型微生物杀虫剂及其产业化关键技术，特别是温室刺吸式害虫如蚜虫等，它们繁殖力强，抗药性强，更需要生物防治。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株寄生曲霉菌及其制备方法，所述寄生曲霉菌可应用于制备真菌杀虫剂或含真菌成分的混合杀虫剂，来防治蚜虫等害虫。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一株寄生曲霉菌，所述寄生曲霉菌是从因真菌寄生自然死亡的蚜虫中筛选出的寄生曲霉菌株Aspergillus parasiticus RWSF001-02，已于2016年9月21日保藏于“广东省微生物菌种保藏中心”，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC NO：60080，菌株的分类命名为寄生曲霉菌株Aspergillus parasiticus RWSF001-02。

本发明获得所述寄生曲霉菌Aspergillus parasiticus RWSF001-02的步骤为：首先选取因真菌寄生自然死亡的蚜虫，利用75%的酒精浸泡30 min后用蒸馏水冲洗3～5次，将处理感染的蚜虫放入到PDA培养基的固体平板中并在温度为28℃培养48h，然后挑取单菌落进行分离，并对分离得到的几株菌株进行室内防治蚜虫效果试验，反复筛选出一株具有高杀虫性、生长状态好的寄生曲霉菌株。

为了进一步提高本发明所提供的菌株的长势及其产孢性状以便更适于孢子批量生产，将筛选出的该菌株菌种转接到PDA液体培养基中，并置于摇床上在28℃环境下培养24h，制成菌丝液体种子。将所述菌丝液体种子按照2%～5%的接种量接种到由质量比为1：（1～3）：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中，保持空气湿度50%，在温度为25℃～30℃条件下培养3～5天，待固体培养基表面布满孢子后将该固体培养基进行风干，从而制成含量大于8×10⁸/g的孢子粉产品。

本发明所得到的菌株具有以下生物学特性：

菌落形态特征：

将经PDA液体培养基培养所获得的菌丝液体种子接种到由玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中培养3～5天后，所得菌落初为白色，黄绿色，继而变成黄褐色；产孢量达8×10⁸/g；分生孢子头呈放射形，少有疏松柱状，分生孢子梗多为单层，少有双层，分生孢子椭圆形。

生长特性：

对该菌株进行生长特性研究，获得其最适宜的生长温度为25℃～30℃，最适宜空气湿度为50%。

将经固体培养基中培养3～5天后得到的菌株菌落，提取其基因组DNA，并采用常规的寄生曲霉菌DNA扩展引物对该DNA进行扩增，并分别用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，切割所需DNA目的条带对该菌株的ITS DNA序列的PCR产物进行测序，测序结果见基因序列表SEQ.ID No.1。从所述基因序列表SEQ.ID No.1中分析得出该菌株的DNA-ITS序列共有574bp，该菌株属于与曲霉属Aspergillus的寄生曲霉Aspergillu sparasiticus RWSF001-02基因同源性概率较高。

综上所述，通过综合该菌株的菌落形态、分生孢子形态、培养条件及分子生物学鉴定结果表明，该菌株属于曲霉属Aspergillus的寄生曲霉Aspergillu sparasiticus RWSF001-02。

本发明提供的所述寄生曲霉菌株从孢子萌发开始侵染到菌体重新在虫体上产生孢子的过程可分为10个阶段，即经过孢子附着于寄主表皮、孢子萌发、穿透表皮、菌丝在血腔内生长、毒素产生、寄主死亡、菌丝侵入寄主的所有器官、菌丝穿出表皮、产生孢子、侵染单位的扩散这十个阶段。该菌株只要能够完成前四个阶段，就能够对寄主造成入侵和感染；当病原真菌在体内的菌丝大量繁殖时，就可导致寄主死亡。因此，本发明提供的所述寄生曲霉菌或含有所述寄生曲霉菌孢子的孢子粉可用来制备杀虫剂，尤其是采用含有所述寄生曲霉菌孢子的孢子粉来制备的杀虫剂喷雾水溶液中，所述寄生曲霉菌孢子含量在8×10⁵～4×10⁶时对蚜虫具有较高的防治率。

在利用本发明提供的所述寄生曲霉菌进行防治蚜虫时，将由质量比为1：（1～3）：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基制得的所述曲霉菌株孢子粉产品用水稀释500～1000倍后进行喷雾，喷雾3～5天后，当环境湿度在75%以下时，被该菌种感染的蚜虫虫体变黑、干瘪，用体式显微镜可以发现蚜虫表皮气孔处有菌丝出现；而当环境湿度在75%以上时蚜虫虫体呈现黄褐色且全身覆满寄生曲霉孢子。结果表明，本发明提供的所述曲霉菌株被水稀释倍数1：500与1：750的蚜虫防效可达92%以上。因此，本发明提供的所述寄生曲霉菌可用于防治各种植物蚜虫，能有效地控制蚜虫种群数量。

附图说明

图1、本发明实施例提供的寄生曲霉菌株在30万倍光学显微镜下的分生孢子梗形态。

图2、本发明实施例提供的寄生曲霉菌株在光学显微镜下的分生孢子头形态。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

本实施例提供一株从因真菌寄生自然死亡的萝卜蚜虫中筛选出的寄生曲霉菌株，该菌株的获取、培养和鉴定方法包括以下步骤：

菌株的分离：首先选取因真菌寄生自然死亡的萝卜蚜虫，利用75%的酒精浸泡30 min后用蒸馏水冲洗3～5次，然后将处理后感染的蚜虫放入到PDA培养基的固体平板中并在温度为28℃培养48h，然后挑取单菌落进行分离，并对分离得到的几株菌株进行室内蚜虫生测试验，反复筛选出一株具有高杀虫性、生长状态好的菌株。

菌株的鉴定：将经PDA液体培养基培养所得的菌丝液体种子接种到由质量比为1：1：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中培养3～5天后观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小的具体形态特征参见图1和图2。从图中可以看出所得菌落初为白色、黄绿色，继而变成黄褐色；分生孢子头呈放射形、少有疏松柱状，分生孢子梗多为单层、少有双层呈椭圆形。

菌株的DNA ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定：从该菌株基因组DNA中扩增出1条约600bp的序列，PCR产物经测序后所得序列通过Blast与GenBank中已有的核酸序列进行对比，结果表明该菌株的DNA ITS序列测序结果见SEQ.ID No.1，该测序序列和Aspergillu sparasiticus RWSF001-02的序列同源性极高，从而验证该菌株为曲霉菌株Aspergillus parasiticus RWSF001-02。

为了进一步提高本发明所提供的菌株生长势及其产孢性状、以便更适于孢子批量生产，将该菌株的菌种转接到PDA液体培养基中，并置于摇床上在28℃环境下培养24h，制成菌丝液体种子，所述菌丝液体种子按照2%～5%的接种量接种到由质量比为1：1：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中，保持空气湿度50%，在温度为25℃～30℃条件下培养3-5天，待固体培养基表面布满孢子后将该固体培养基进行风干，从而制成含量大于8×10⁸/g的孢子粉产品。

对本实施例制得的所述寄生曲霉菌孢子粉产品的抑制蚜虫效果进行测定，试验效果如下：

试验一：本试验田设在郑州市中牟县德谷园蔬菜大棚内，供试作物品种是小西葫芦蚜虫。试验设所述寄生曲霉与水稀释比按照1：500，1：750，1：1000倍稀释，并进行清水空白对照。每个试验处理小区面积15m²、重复3次试验，小区随机区组排列，采用背负式手动喷雾器喷雾，喷液量为40kg/667m²，于傍晚前喷雾并保证棚内相对湿度≥85%。为了防止处理间相互干扰，施药时用塑料膜遮隔相邻小区。处理前在小区内5点取样，每个点选2株植株，并在选定植株上标定3片无翅成蚜寄生量不少于50头的叶片，调查虫口基数，于处理后3d、5d、7d统计蚜虫死亡情况，计算防治效果，结果如表1所示，具体计算公式如下、

虫口减退率（%）=（处理前虫口基数—处理后各天残留虫数）/处理前虫口基数×100%

防治效果（%）=（处理区虫口减退率—对照区虫口减退率）/（100—对照区虫口减退率）×100%

表1不同稀释比例的寄生曲霉对西葫芦蚜虫的防治效果

从表1中可以看出喷雾处理3d后，稀释倍数1：500与稀释倍数 1：750的所述寄生曲霉菌孢子粉产品对蚜虫的防治差异不显著，而稀释倍数1：500和1：750与稀释倍数1：1000的所述寄生曲霉菌孢子粉产品存在显著差异。同时，结果还表明喷雾处理后3d稀释倍数1：500与 1：750蚜虫防效均在90%以上，稀释倍数1：1000的蚜虫防效也在89%以上。表明寄生曲霉对蚜虫的防治效果显著，说明喷施5d后蚜虫基本都被感染，7d后也是持续控制状态，有效的解决了化学农药防效短的缺点。因此，所述寄生曲霉菌孢子粉产品对蚜虫的防治具有专一性强、无污染、持续防治的优点。

试验二：本试验田设在鹤壁市山城区石林镇人元生物技术发展有限公司厂区，供试作物品种是田间黎科杂草蚜虫，试验设寄生曲霉与水比例按照1：500，1：750，1：1000倍稀释和空白对照共4个处理，每个处理小区面积1m²、重复3次，小区随机区组排列。采用背负式手动喷雾器喷雾，喷液量40kg/667m²，于傍晚前喷雾，防止室外紫外线杀死真菌，同时环境相对湿度较大，为了防止处理间相互干扰，施药时用塑料膜遮隔相邻小区。处理前在小区内3点取样每个点选2株植株，并在选定植株上标定3片无翅成蚜寄生量不少于20头的叶片，调查虫口基数，于喷雾处理3d、5d、7d统计蚜虫死亡情况，计算防治效果，结果如表2所示。

表2不同稀释比例的蚜虫寄生曲霉防治黎科杂草蚜虫试验效果

从表2中可以看出喷雾处理3d后，稀释倍数1：500与稀释倍数 1：750对蚜虫的防治差异不显著，稀释倍数1：500和1：750与稀释倍数1：1000存在显著差异；结果还表明喷雾处理后3d稀释倍数1：500与 1：750蚜虫防效均在91%以上，稀释倍数1：1000的蚜虫防效也在86%以上。表明寄生曲霉对蚜虫的防治效果显著，说明喷施5d后蚜虫基本都被感染，7d后也是持续控制状态，有效的解决了化学农药防效短的缺点。因此，所述寄生曲霉菌孢子粉产品对蚜虫的防治具有专一性强、无污染、持续防治的优点。

试验三：本试验田设在北京市比奥瑞生物科技有限公司蔬菜大棚内，供试作物品种是豇豆，试验设寄生曲霉与水比例按照1：500，1：750，1：1000倍稀释和空白对照共4个处理，每个处理小区面积15m²，重复3次，小区随机区组排列。采用背负式手动喷雾器喷雾，喷液量40kg/667m²，于傍晚前喷雾，保证棚内相对湿度≥85%，为了防止处理间相互干扰，施药时用塑料膜遮隔相邻小区。处理前在小区内3点取样，每个点选2株植株，并在选定植株上标定3片无翅成蚜寄生量不少于30头的叶片，调查虫口基数，于喷雾处理后3d、5d、7d统计蚜虫死亡情况，计算防治效果，结果如表3所示。

表3不同稀释比例的蚜虫寄生曲霉防治豇豆蚜虫试验效果

从表3中可以看出喷雾处理3d后，稀释倍数1：500与稀释倍数1：750对蚜虫的防治差异不显著，稀释倍数1：500和1：750与稀释倍数1：1000存在显著差异；结果还表明喷雾处理3d后的稀释倍数1：500与1：750蚜虫防效均在92%以上，稀释倍数1：1000的蚜虫防效也在89%以上。表明寄生曲霉对蚜虫的防治效果显著，说明喷施5d后蚜虫基本都被感染，7d后也是持续控制状态，有效的解决了化学农药防效短的缺点。因此，所述寄生曲霉菌孢子粉产品对蚜虫的防治具有专一性强、无污染、持续防治的优点。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。