本发明涉及一种项头孢霉菌原生质体的制备方法。
背景技术：
顶头孢霉-内酰胺类抗生素的主要生产。但因丝状真菌的细胞壁结构相当复杂，将外源基因转化入顶头孢霉中构建转化体系比较困难。利用原生质体来完成转化已被证实为有效的手段。在原生质体制备和再生过程中，酶解条件、菌丝状态和再生培养基种类是重要影响因素。本研究考察了合适的酶的种类、复配比及酶解时间，筛选了制备顶头孢霉原生质体的最佳酶解条件。同时，本试验结果提示菌丝状态对原生质体的制备也有重要影响，这一点此前未得到充分关注。
菌丝的生长状态会改变细胞壁成分，因而与酶解细胞壁制备原生质体的效果密切相关，并显著影响原生质体的再生率。顶头孢霉极少产生孢子，菌体质地松软，制备的孢子悬液批次间的差异很大，因此接种时难以定量控制。并且，相同菌龄的菌体由于菌丝分化状态不同，导致所制备的原生质体质量差异明显。可见，“菌龄”无法准确表述菌丝状态。而镜检下的菌丝分化状态则可以作为衡量菌丝生长状态最直接的指标。
技术实现要素：
本发明提出一种项头孢霉菌原生质体的制备方法。
一种项头孢霉菌原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶溶于渗透压缓冲剂中，经0.22微米微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用；
（2）用生理盐水洗下顶头孢霉孢子，接种于CSL培养基50ml250m1摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养4d；
（3）然后转接于YPS培养基50ml250ml摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养18h；
（4）取菌液50ml离心6600xg10min收集菌体；准确称取菌丝体1g湿重，用无菌水洗涤3次，离心收集菌体，重悬于10mmol/LDTT溶液10ml中，30-50℃条件下振荡250r/min孵育1h进行预处理；取该预处理液离心6600×g5min收集菌体，用渗透压缓冲剂洗涤3次6600×g，5min，弃去上清液；然后加入不同酶解液各10ml，30℃条件下振荡100r/min孵育2～3h；镜检直至大多数菌丝开始释放原生质体；
（5）加入4倍体积的渗透压缓冲剂终止反应，用四层擦镜纸过滤除去菌丝；离心950×g5min收集原生质体，用渗透压缓冲剂5ml洗涤后再次离心，将原生质体重悬于渗透压缓冲剂0．5ml中；
（6）将悬浮液用渗透压缓冲剂稀释100倍后，即得。
所述生理盐水浓度为0.85％～0.90％。
所述步骤（2）中振荡速率为220r/min。
所述步骤（4）中温度为35℃。
本发明所述方法制备的项头孢霉菌原生质体，可有效获得较多量的生质体、活性很好，再生率很高。
具体实施方式
实施例1。
一种项头孢霉菌原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶溶于渗透压缓冲剂中，经0.22微米微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用；
（2）用生理盐水洗下顶头孢霉孢子，接种于CSL培养基50ml250m1摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养4d；
（3）然后转接于YPS培养基50ml250ml摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养18h；
（4）取菌液50ml离心6600xg10min收集菌体；准确称取菌丝体1g湿重，用无菌水洗涤3次，离心收集菌体，重悬于10mmol/LDTT溶液10ml中，30-50℃条件下振荡250r/min孵育1h进行预处理；取该预处理液离心6600×g5min收集菌体，用渗透压缓冲剂洗涤3次6600×g，5min，弃去上清液；然后加入不同酶解液各10ml，30℃条件下振荡100r/min孵育2～3h；镜检直至大多数菌丝开始释放原生质体；
（5）加入4倍体积的渗透压缓冲剂终止反应，用四层擦镜纸过滤除去菌丝；离心950×g5min收集原生质体，用渗透压缓冲剂5ml洗涤后再次离心，将原生质体重悬于渗透压缓冲剂0．5ml中；
（6）将悬浮液用渗透压缓冲剂稀释100倍后，即得。
所述生理盐水浓度为0.85％～0.90％。
实施例2。
一种项头孢霉菌原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶溶于渗透压缓冲剂中，经0.22微米微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用；
（2）用生理盐水洗下顶头孢霉孢子，接种于CSL培养基50ml250m1摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养4d；
（3）然后转接于YPS培养基50ml250ml摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养18h；
（4）取菌液50ml离心6600xg10min收集菌体；准确称取菌丝体1g湿重，用无菌水洗涤3次，离心收集菌体，重悬于10mmol/LDTT溶液10ml中，30-50℃条件下振荡250r/min孵育1h进行预处理；取该预处理液离心6600×g5min收集菌体，用渗透压缓冲剂洗涤3次6600×g，5min，弃去上清液；然后加入不同酶解液各10ml，30℃条件下振荡100r/min孵育2～3h；镜检直至大多数菌丝开始释放原生质体；
（5）加入4倍体积的渗透压缓冲剂终止反应，用四层擦镜纸过滤除去菌丝；离心950×g5min收集原生质体，用渗透压缓冲剂5ml洗涤后再次离心，将原生质体重悬于渗透压缓冲剂0．5ml中；
（6）将悬浮液用渗透压缓冲剂稀释100倍后，即得；
（7）所述步骤（2）中振荡速率为220r/min。
实施例3。
一种项头孢霉菌原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶溶于渗透压缓冲剂中，经0.22微米微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用；
（2）用生理盐水洗下顶头孢霉孢子，接种于CSL培养基50ml250m1摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养4d；
（3）然后转接于YPS培养基50ml250ml摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养18h；
（4）取菌液50ml离心6600xg10min收集菌体；准确称取菌丝体1g湿重，用无菌水洗涤3次，离心收集菌体，重悬于10mmol/LDTT溶液10ml中，30-50℃条件下振荡250r/min孵育1h进行预处理；取该预处理液离心6600×g5min收集菌体，用渗透压缓冲剂洗涤3次6600×g，5min，弃去上清液；然后加入不同酶解液各10ml，30℃条件下振荡100r/min孵育2～3h；镜检直至大多数菌丝开始释放原生质体；
（5）加入4倍体积的渗透压缓冲剂终止反应，用四层擦镜纸过滤除去菌丝；离心950×g5min收集原生质体，用渗透压缓冲剂5ml洗涤后再次离心，将原生质体重悬于渗透压缓冲剂0．5ml中；
（6）将悬浮液用渗透压缓冲剂稀释100倍后，即得。
实施例4。
一种项头孢霉菌原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶溶于渗透压缓冲剂中，经0.22微米微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用；
（2）用生理盐水洗下顶头孢霉孢子，接种于CSL培养基50ml250m1摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养4d；
（3）然后转接于YPS培养基50ml250ml摇瓶中，28℃条件下振荡220r/min培养18h；
（4）取菌液50ml离心6600xg10min收集菌体；准确称取菌丝体1g湿重，用无菌水洗涤3次，离心收集菌体，重悬于10mmol/LDTT溶液10ml中，30-50℃条件下振荡250r/min孵育1h进行预处理；取该预处理液离心6600×g5min收集菌体，用渗透压缓冲剂洗涤3次6600×g，5min，弃去上清液；然后加入不同酶解液各10ml，30℃条件下振荡100r/min孵育2～3h；镜检直至大多数菌丝开始释放原生质体；
（5）加入4倍体积的渗透压缓冲剂终止反应，用四层擦镜纸过滤除去菌丝；离心950×g5min收集原生质体，用渗透压缓冲剂5ml洗涤后再次离心，将原生质体重悬于渗透压缓冲剂0．5ml中；
（6）将悬浮液用渗透压缓冲剂稀释100倍后，即得；
（7）所述步骤（4）中温度为35℃。