预，并设正常 细胞空白对照组，在37°C，5% 0)2饱和湿度的培养箱培养24h。
[0041] 2. 1不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的形态学观察
[0042] 在倒置相差显微镜下观察各组BMSCs的形态特征并予以拍照。
[0043] 2. 2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的微核率检测
[0044] 收集各组细胞在CO2培养箱中培养24h后，胰酶消化细胞后，收集细胞，4°C离心 1000r/min，5min，去上清，加入37°C水浴的KCl溶液，水浴锅中静置30min，去上清加入甲醇 和冰乙酸的固定液，固定细胞，制片。吉姆萨染液中染色。显微镜下观察，每组各染3个标 本，每个标本观察1000个细胞，记录有微核的细胞数，重复三次实验。判断标准：选取细胞 完整，微核和主核完全分离或与主核相切，圆形或椭圆形，大小为主核三分之一以下，结构 和主核一致，边缘光滑。
[0045] 2. 3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的染色体畸变率检测
[0046] 收集各组细胞在CO2培养箱中培养24h后，分别加秋水仙素，培养3h后，消化细 胞，离心收集细胞，加入37°C水浴的KCl低渗液，再加甲醇和冰乙酸固定液反复固定细胞， 同时准备冰水浸泡玻片，吸管抽吸细胞悬液滴在冰玻片上，干燥后，放入吉姆萨染液中染色 10min，显微镜下观察，每组各染3个标本，每个标本观察1000个细胞，记录染色体缺失及裂 隙的数目，重复三次实验。判断标准：选取制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、 长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置，损伤长度大于染色单体的宽度为 断裂，损伤的长度小于染色单体的宽度为裂隙。
[0047] 2. 4不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的细胞凋亡检测
[0048] 收集各组细胞培养24h后，用PBS洗涤细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，吹打 细胞后收集入离心管。4°C离心1000r/min，5min，去上清，用PBS再次洗涤细胞，4°C离心 100〇1'/111；[11，5111；[11后，去上清加入195以1^4111161；[11￥-?11'(]结合液轻轻重悬细胞。再加入 5 μ LAnnexin V-FITC，轻轻混勾，室温避光孵育10min，包裹锡纸。4°C离心1000r/min，5min， 弃上清，加入190 μ L Annexin V-FITC结合液轻轻混匀并重悬细胞，加入10 μ L PI染色液， 轻轻混匀，冰浴避光静置。上流式细胞仪检测细胞凋亡，设三次重复。
[0049] 3统计学处理方法
[0050] 应用SPSS16. 0软件进行统计分析，所得计量资料均采用均数和标准差（? ±s )表 示。采用单因素方差分析，进一步采用LSD或Dunnet法进行两两比较，P〈0. 05为差异有统 计学意义。
[0051] 4 结果
[0052] 4. I MTT法测定不同浓度肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs增殖的影响
[0053] 由表1-1、1-2、1-3得出各分子量段肉苁蓉超滤物在浓度0. 8g/L时，对CdCl2诱导 的BMSCs增殖促进作用最明显。
[0054] 表1-1不同浓度10, 000分子量以下肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的影响（η =5，-T ± ）
[0055]
[0056] 注：*与对照组相比，Ρ〈0· 05
[0057] 表1-2不同浓度10, 000-100, 000分子量肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的影 口向（n = 5，X ± 5·)
[0059] 注与对照组相比，Ρ〈0· 05
[0060] 表1-3不同浓度100, 000-200, 000分子量肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的影 口向（n = 5，J ± s )
[0062] 注与对照组相比，Ρ〈0· 05
[0063] 4. 2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs增殖的形态学观察
[0064] 倒置相差显微镜下观察可见，空白对照组：BMSCs 24h后贴壁细胞数量增多，逐渐 形成数个大小不同的细胞集落，这时细胞形态均一，排列紧密，多呈长梭形。模型对照组： BMSCs 24h时贴壁缓慢，可见细胞悬浮并开始死亡，细胞生长缓慢，数量不多。与对照组相 比，诱导组即各分子量肉苁蓉超滤物组均可见部分细胞贴壁，贴壁细胞数量有不同程度增 加，见图1。
[0065] 4. 3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的微核率、染色体畸变率、凋 亡的影响
[0066] 4. 3. 1不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs微核率影响
[0067] 结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs微核率明显增高，差异有统 计学意义（P〈〇. 05);与模型对照组比较，10, 000分子量以下组、10, 000-100, 000分子量 组、100, 000-200, 000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs微核率明显降低，其中以10, 000分 子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义（P〈〇. 05) ;10, 000-100, 000分子量组、 100, 000-200, 000分子量组与10, 000分子量以下组比较，差异有统计学意义（P〈0. 05)。见 表2及图2。
[0068] 表2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs微核率影响（η = 3, ·Γ二s' )
[0070] 注与空白对照组比较，Ρ〈0. 05 ; Λ与模型对照组比较，Ρ〈0. 05彳与10, 000分子 量以下组比较，Ρ〈〇. 05。
[0071] 4. 3. 2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导BMSCs的染色体畸变率影响
[0072] 结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs染色体畸变率明显增高，差异有 统计学意义（Ρ〈〇. 05);与模型对照组比较，10, 000分子量以下组、10, 000-100, 000分子量 组、100, 000-200, 000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs染色体畸变率明显降低，其中以10, 000 分子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义（Ρ〈〇. 05) ;10, 000-100, 000分子量组、 100, 000-200, 000分子量组与10, 000分子量以下组比较，差异有统计学意义（Ρ〈0. 05)。见 表3及图3。
[0073] 表3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs染色体畸变率影响（η = 3, )
[0075] 注与空白对照组比较，P〈0. 05 ; Λ与模型对照组比较，P〈0. 05彳与10, 000分子 量以下组比较，P〈〇. 05。
[0076] 4. 3. 3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs细胞凋亡影响
[0077] 结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs凋亡率明显增高，差异有统 计学意义（P〈〇. 05);与模型对照组比较，10, 000分子量以下组、10, 000-100, 000分子量 组、100, 000-200, 000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs凋亡率明显降低，其中以10, 000分 子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义（P〈〇. 05) ;10, 000-100, 000分子量组、 100, 000-200, 000分子量组与10, 000分子量以下组比较，差异有统计学意义（P〈0. 05)。见 表4及图4。
[0078] 表4不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs凋亡率影响（η = 3, T士.s' )
[0080] 注与空白对照组比较，ρ〈0. 05 ; Λ与模型对照组比较，ρ〈0. 05彳与10, 000分子 量以下组比较，Ρ〈〇. 05。
[0081] 由上述实验可知，肉苁蓉提取物能够作为保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳 定性的药物使用。
[0082] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质 干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为肉苁蓉提取物对镉元素诱导 的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的分子量为 200, 000 以下。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的分子量为10, 000以 下。6. 根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的浓度为0. 8g/ L〇7. 根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的制备方法为： 将肉苁蓉水提，用超滤膜过滤水提液，根据分子量要求收集截留液或透过液，干燥，得到肉 灰蓉提取物。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述将肉苁蓉水提是加入8倍重量的水 提取1次，提取时间为1小时；再加入6倍重量的水提取2次，每次提取1小时。
【专利摘要】本发明提供肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本申请人通过实验发现：肉苁蓉超滤膜提取物可以减小CdCl2诱导的BMSCs微核数、微核率、染色体畸变率的发生，可以降低细胞的凋亡率；与模型组相比均具有显著性差异（p<0.05）。中药肉苁蓉提取物可以通过减少细胞的凋亡来降低BMSCs的微核率和染色体畸变率，以提高BMSCs的遗传稳定性。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105385653
【申请号】CN201510719183
【发明人】刘永琦, 安耀荣, 张志明, 雍文兴, 张月梅
【申请人】甘肃中医药大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月29日