质粒DNA浓缩纯化
[0101]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环栗，400rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA浓缩液。
[0102]2.3.1浓缩液的洗滤
[0103]第一次洗滤:
[0104]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去透过液4，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA浓缩液。
[0105]第二次洗滤:
[0106]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA浓缩液。
[0107]第三次洗滤:
[0108]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA裂解液最终浓缩液。
[0109]2.4第三步精细纯化
[0110]将质粒DNA裂解液浓缩液中加入Triton X_11430g使终浓度为1.5% (W/V)，涡旋振荡后置于冰浴中30min，期间多次混匀样品。
[0111]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗，400rpm循环30min，经0.22 μπι中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液。
[0112]浓缩系统处理完毕后，将透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入0.0lM PBS8L，开启循环栗，400rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA纯化液。
[0113]第一次洗滤:
[0114]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去透过液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA纯化液。
[0115]第二次洗滤:
[0116]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA纯化液。
[0117]第三次洗滤:
[0118]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA纯化液。
[0119]2.4除菌过滤
[0120]将得到质粒DNA纯化液，用0.22 μπι囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品O
[0121]将经过上述处理后的得到的质粒DNA成品保存于4°C。
[0122]3质粒DNA回收率测定
[0123]将裂解液和已知定量质粒使用凝胶核酸电泳，跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，再以伯乐公司ImageLab凝胶成像系统计算出裂解液中质粒含量。通过计算本发明的质粒DNA回收率高于80%。
[0124]4质粒DNA质量检测
[0125]对纯化的质粒DNA样品进彳丁质粒DNA含量，纯度，超螺旋比例，蛋白污染，宿主基因组DNA及RNA进行检测，以分析纯化工艺的有效性。
[0126]3.1质粒DNA含量的检测:
[0127]用紫外分光光度计测其在波长260nm时的吸收值，测量3次，取平均值，每毫升质粒含量应不低于lmg。
[0128]3.2质粒DNA纯度检测:
[0129]用紫外分光光度计测其在波长260nm和280nm时测定吸收值，其260nm/280nm比值应在1.8?2.0之间。
[0130]3.3蛋白污染检测。
[0131]使用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行。蛋白质含量低于10 μ g/mL。
[0132]3.4基因组DNA和RNA污染物检测
[0133]使用琼脂糖核酸电泳跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，应检测不到相应条带。
[0134]3.5超螺旋含量检测方法
[0135]使用琼脂糖核酸电泳跑胶检测，电泳图像用凝胶成像仪显现并得到，再以伯乐公司ImageLab凝胶成像系统计算出超螺旋体DNA质粒及各类质粒构型的图像映像点，从而计算出超螺旋体DNA质粒在总DNA质粒量的百分比。超螺旋体DNA质粒占总质粒量的比例不少于90%。
[0136]综上所述，利用本发明纯化得到的质粒DNA。
[0137]实施例2
[0138]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗，400rpm循环30min，经0.22 μπι中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0139]I截留液的洗滤
[0140]第一次洗滤:
[0141]将1L无菌的0.01Μ PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0142]第二次洗滤:
[0143]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0144]第三次洗滤:
[0145]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0146]质粒DNA裂解液的收集
[0147]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0148]2质粒DNA浓缩纯化
[0149]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环栗，400rpm循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA浓缩液。
[0150]2.1浓缩液的洗滤
[0151]第一次洗滤:
[0152]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去透过液4，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA浓缩液。
[0153]第二次洗滤:
[0154]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA浓缩液。
[0155]第三次洗滤:
[0156]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA裂解液最终浓缩液。
[0157]实施例3
[0158]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗，400rpm循环30min，经0.45 μπι中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0159]I截留液的洗滤
[0160]第一次洗滤:
[0161]将1L无菌的0.01Μ PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0162]第二次洗滤:
[0163]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0164]第三次洗滤:
[0165]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0166]质粒DNA裂解液的收集
[0167]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0168]2质粒DNA浓缩纯化
[0169]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环栗，400rpm循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩