一种利用整合宿主因子来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明是设及一种基于PCR的基因合成技术为基础的核酸分子合成和扩增技术 的方法，主要设及一种耐热的，与DNA双链结合的整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成 技术灵敏度的方法。
【背景技术】
[0002] -步到位PCR基因合成又称一步到位重叠延伸PCR，是一种简单快速的基因 合成方 '法一Simplifiedgenesynthesis:曰one-stepapproachtoPCR-b曰sedgene construction是由Wu博± 2006年提出的，具体的步骤如下：设计需要合成DNA序列的重 叠寡核巧酸大约50bp，每个序列之间都有大约25bp的重叠寡核巧酸，W覆盖整个DNA序列 (200到1500碱基），将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作为模板的 上述的混合重叠寡核巧酸的反应液中加入IHF，按照常规PCR的解链，退火，延伸S个步骤 进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。
[0003] 体外DNA合成技术是合成生物学最基础、最有力的工具，可W突破传统克隆技术 的局限，实现从头合成、按需合成和生物大分子的定向改造。基于PCR的基因合成又称重叠 延伸PCR，是一种简单快速的基因合成方法，重叠延伸PCR使用长约50bp、互相重叠约25bp 的寡核巧酸引物，通过一步简单的重叠延伸PCR，然后用最外端的两条引物进行扩增就可W 得到完整的基因。此技术利用PCR能够在体外进行有效的基因重组，具有广泛而独特的应 用价值。
[0004] 整合宿主因子（IH巧是调控原核生物基因复制转录的蛋白之一，它是一种热稳定 的DNA结合蛋白，能与DNA结构中的小槽处相互作用使之发生结构改变从而达到调控基因 的表达转录等作用，IHF由a亚基和P亚基两个异源亚基构成，a亚基和P亚基之间有 30%的同源性.已有研究报道单独表达的1邸-〇亚基难与〇臟结合，而1邸-6亚基可与 DNA形成稳定的复合物。
[0005]IHFP的DNA序列与文献报道度onnefoyE等，EMB0J，10(3) :687-696， 1991) 一致GenBank:LM995446. 1 其序列为ATGACCMGTCAGAA1TGAT
[0006] 在PCR反应中，反应液的组成及热循环反应条件的优化是决定反应成败的关键， 对于重叠延伸PCR反应而言更是如此。为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸PCR反 应一般采用高保真DNA聚合酶。传统的高保真DNA聚合酶虽具有较好的校正能力，但其扩 增效率一直难W令人满意。虽然一些既具有校正功能又具有很强延伸能力的DNA聚合酶已 陆续被开发应用，但是效果也仍需加强。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术 灵敏度的方法，并且能够有效地提高合成和扩增目标核酸序列的灵敏度。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过如下 步骤实现：
[0010] S1 :设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核巧酸；其中，每个序列都有25bp 的重叠寡核巧酸，W覆盖整个DM序列（200到1500碱基）；
[0011] S2 :将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作为模板的上述混 合重叠寡核巧酸的反应液中加入IHF原液；其中，IHF原液的浓度为10化g/y1 ;
[0012] S3:按照常规PCR的解链，退火，延伸S个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段 合成并且扩增。
[0013] 采用上述方案后，本发明中将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W 及作为模板的混合重叠寡核巧酸的反应液中加入IHF原液，按照常规PCR的解链，退火，延 伸=个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明方法能够特异性 地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明中整合宿主因子活性电泳检测图；
[001引图2为本发明中整合宿主因子对PCR合成影响的电泳检测图；
[0016] 图3为本发明中合成产物光密度值结果图；
[0017] 图4为本发明中IHF0SDS-PAGE电泳检测图。
【具体实施方式】
[0018] IHF-P对基于PCR的基因合成效率的影响：
[0019] 将不同浓度的IHF-P蛋白加入到相同量的祀T-22b质粒中，室溫放置lOmin后用 1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，pET-2化质粒的 条带发生了明显的移动，结果如图1所示。图1中：
[0020] 1 :质粒狂）与shiftbuffer(SB)混合液；
[0021] 2 :Z与SB混合液体系内加入0. 5y1IHF;
[002引 3 :Z与SB混合液体系内加入liilIHF;
[002引 4 :Z与SB混合液体系内加入2y1IHF;
[0024] 5 :Z与SB混合液体系内加入4ylIHF;
[002引 6 :Z与SB混合液体系内加入6ylIHF;
[002引 7 :Z与SB混合液体系内加入8y1IHF;
[0027] 8 :Z与SB混合液体系内加入9ylIHF。
[002引为了探索IHF-0对基于PCR的基因合成效率的影响，我们使用PCR对IHF-0蛋 白基因进行合成，在分别加入了不同浓度的IHF-P蛋白后，合成产物经1% (W/V)琼脂糖 凝胶电泳检测，发现加了IHF-P蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如 下变化：在一定浓度的IHF-P蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效 率反而变小，结果如图2所示。而且我们对合成产物的光密度值进行了测定，结果如图3所 /J、- 0
[0029] 本发明一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通 过如下步骤实现：
[0030]S1 :设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核巧酸；其中，每个序列都有25bp 的重叠寡核巧酸，W覆盖整个DM序列（200到1500碱基）；
[003。S2 :将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作为模板的上述混 合重叠寡核巧酸的反应液中加入IHF;其中，IHF原液的浓度10化g/y1;
[0032]S3 :按照常规PCR的解链，退火，延伸S个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段 合成并且扩增。
[0033] 上述混合重叠寡核巧酸（所有的重叠寡核巧酸链）由LifeTechnologies公司合 成。
[0034] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0035] 实施例1 :
[0036] 本发明中，寡核巧酸引物设计过程如下：
[0037] 1、使用的软件：GenSearch
[0038] 2、GenSearch输出的结果见下表：
[0039] 设计出的IHFgene的合成引物见表1:
[0040]
[0041]
[0042]表1
[004引实施例2 :IHF的制备
[0044] ①将来源于大肠杆菌的IHFa或IHFP亚基分别插入阳T2化表达载体中，通过 连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体阳T22-IHFa或者 PET22-IHFP；
[0045] ②将构建好的重组载体祀T22-IHFa或者祀T22-IHFP转化大肠杆菌化21，取含 重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按体积比1%接种到50ml的 LB培养液中，放入37°C摇床培养至其0D值为0. 6-0. 8 ;加入IPTG，将菌液放入37°C摇床中 诱导表达3小时，摇床转速为16化pm;
[0046] ③取诱导表达后的菌液离屯、得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白 表达情况。结果如图4所示。
[0047] ④IHF的纯化
[0048] 利用上述操作②与③的操作大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液经离屯、 (3000Xg) 15min，收集大肠杆菌菌体，-70°C冷冻放置过夜。
[0049] 菌体悬浮在裂解缓冲液（组分为：0.1M，0.02M邸TA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶）（pH 7. 5)，30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离屯、（120000Xg)90min。上清液W阴离子交换柱 PrepQ纯化。W25mMTris/肥1，ImM邸TA(pH7.W冲洗，再W化C1梯度洗脱。之后，W肝 素亲和柱纯化，W化C1梯度洗脱，得到纯度为95%左右的IHF蛋白原液。经测定IHF蛋白 原液的浓度为10化g/y1。
[0050] 经检测，本实验获得的IHFP的DM序列与文献报道度onne化yE等，EMBOJ， 10(3) :687-696,，1991) 一致；GenBank:LM995446. 1 其序列如序列表中沈QIDNO. 1 所示。 [00川⑥IHF的活性检测
[0052] 按照表2配置10y1的反应体系
[0053]
[0054]表 2
[005引如表2所示，在反应液中，加入不同体积的实施例2得到的IHF蛋白（浓度相同）， 室溫下静置lOmin。之后分别取5 反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图3。可见 在加入IHF蛋白后，IHF与双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化 出的蛋白IHF有活性并且与环状的双链DNA相互作用。
[0056] 实施例3 :整合宿主因子对PCR合成的影响
[0057] 设计好的寡核巧酸链由LifeTechnologies公司合成。订购的各寡核巧酸链分别 用lOmMTris-肥1(抑8.W溶解至lOOiiM浓度，再将所有的寡核巧酸链混合并用蒸馈水稀 释至得到1yM浓度的寡核巧酸链混合液，在PCR反应体系中加入此寡核巧酸链混合液作模 板，并至所有的寡核巧酸链的终浓度为25nM。
[005引 按表3配制PCR反应液20y1。
[0059]
[0060]表 3
[0061] 在分别加入不同体积的实施例2得到的IHF蛋白（浓度相同）后，合成产物经1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了IHF-P蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没 加的相比有如下变化：在一定浓度的IHF-P蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一 定值后合成效率反而变小，结果见图4。
【主权项】
1. 一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其特征在 于：通过如下步骤实现： 51 :设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重 叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列（200到1500碱基）； 52 :将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重 叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液；其中，IHF原液的浓度为102ng/y1 ; 53 :按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成 并且扩增。
【专利摘要】本发明公开了一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液，按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105200036
【申请号】CN201510602375
【发明人】戚智青, 唐黎, 侯丹, 齐晓雪, 张秀英, 刁勇, 王庆波, 潘海波, 高宏志, 刘楠辛
【申请人】华侨大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月21日