一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种单分子靶向测序方法、装置、系统及 应用。
【背景技术】
[0002] 二代测序技术广泛应用在很多领域，但其内在缺陷带来诸如起始样品量大，测序 时间长，费用高，PCR扩增过程带来的测序错误等开始凸显。以直接针对单个DNA分子的测 序技术（SMS)为特征的新三代测序技术则针对解决二代技术的缺陷应运而生，并越来越多 的引起人们的关注。
[0003] 世界上首个基于单分子测序技术（tSMS)的测序仪是由Helicos公司于2008年推 向市场的。其原理是通过检测单个碱基荧光信号来实现边合成边测序。具体而言，在测序 前，待测DNA被打断成约200bp的片段，并需要在片段3'末端加上40bp带有荧光标记的 poly(A)尾，文库退火形成单链，与芯片上固定的OligodT(40bp)探针结合。Helicos公司 在2012年发表的学术论文则进一步改进了此项技术，把待测的带焚光，但无polyA尾修饰 的单个DNA分子杂交捕获在特定的探针上面进行直接测序。其结果显示出此项技术潜在的 应用前景，尤其是临床应用领域。但Helicos公司发布的产品由于其高昂的价格和不稳定 性等特点，没有得到市场的认可，于2011年底破产。
[0004] 此外，太平洋生物公司的单分子测序仪（SMRT)具有读长长等特点，但是受物理原 件和制作工艺的局限，该仪器通量不高，试剂昂贵，尚未真正应用到临床。因此，利用单分子 技术的优势以及临床需求而开发的单分子靶向测序技术（SMTS)，有望成为应用于遗传病检 测和精准医疗市场新一代测序仪器。
【发明内容】
[0005] 鉴于此，本发明提供了一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用。本发明提供 的单分子靶向测序方法、装置、系统用于对任何一条或多条DNA、RNA、mRNA、染色体、基因组、 或其他核酸序列进行快速和准确地测序。
[0006] 第一方面，本发明提供了一种单分子靶向测序方法，包括：
[0007] ⑴将靶向引物的5'端连接到基底表面；
[0008] (ii)将末端修饰有光学检测标记的模板核酸与所述步骤（i)中连接到基底表面 上的靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；
[0009] (iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；
[0010] (iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记 的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链 的3'端；获得延伸产物；
[0011](V)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤（iii)中靶向引 物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸 序列；
[0012] (vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：
[0013] (vii)重复步骤（iii)至（vi) -次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核 苷酸。
[0014] 本发明通过延伸反应、成像检测和切除光学检测标记分子的反复循环，实现SMTS 实时测序。
[0015] 在本发明一实施例中，所述步骤（i)中，革巴向引物为5'端具有10-30bp的polyT 的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
[0016] 在该实施例中，靶向引物为5'端连接到基底表面的方式为：p〇lyT的5'端连接到 基底表面。
[0017] 在本发明一实施例中，所述步骤（i)中，靶向引物为与模板核酸的至少部分序列 互补的序列。
[0018] 在该实施例中，靶向引物为5'端连接到基底表面的方式为：p〇lyT的5'端连接到 基底表面。
[0019] 在本发明一实施例中，所述步骤⑴中，靶向引物为5'端顺次连接有10_30bp的 P〇lyT以及烷基链的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序 列。
[0020]优选地，所述烷基链为_ (CH2) n_(优选为-(CH2)6_)，其中，n为自然数。
[0021] 在该实施例中，靶向引物为5'端连接到基底表面的方式为：-(CH2)6-通过氨基与 基底表面的环氧基连接。
[0022] 在本发明一实施例中，靶向引物为通过5'端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基 基底（包括但不限于玻璃基底、石英基底等）。在本发明一优选实施例中，将带有光学检测 标记的靶向引物的5'端连接到基底表面的步骤包括：
[0023]a)将环氧基修饰的玻璃基底浸泡在含0. 4-3. 2nM靶向引物的固定液中（优选 45min-120min);清洗基底；
[0024]b)将基底浸入磷酸盐钝化液中，摇晃（优选10-15小时）；清洗基底，获得所述表 面固定有靶向引物的基底。
[0025] 在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，所述固定液为0. 02-0. 311的1(2即04 溶液。
[0026] 在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，所述固定液中革巴向引物的浓度优 选为0. 8-3. 2nM，进一步优选为0. 8-1. 6nM。
[0027] 在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤a中，采用3xSSC+0. 1%Triton, 3x SSC, 150mM K2HP04pH=8. 5清洗基底。
[0028] 在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤b中，摇晃的条件为置于摇床上摇晃 (优选为40-80转/分钟）。
[0029] 在该优选实施方式中，进一步优选地，步骤b中，磷酸盐钝化液为pH= 9. 0， 0. 2-1M(优选 0. 2-0. 8M)K2HP04溶液。
[0030] 在本发明一实施例中，所述模板核酸的3'端和/或5'端带有光学检测标记。
[0031] 在本发明一实施例中，所述光学检测标记为荧光标记。
[0032] 优选地，所述荧光标记物选自荧光素，罗丹明，花青，Cy5, Cy3中的一种或多种。
[0033] 在本发明一优选实施例中，带有荧光标记的核苷酸为单色可逆末端终止子。
[0034] 在本发明一优选实施例中，带有荧光标记的核苷酸为多色可逆末端终止子。
[0035] 如本发明所述的，单色可逆末端终止子为A、T、C、G中的任一种均带有相同的荧光 标记；每次循环只添加一种核苷酸。
[0036] 如本发明所述的，多色可逆末端终止子为A、T、C、G各自带有互不相同的荧光标 记，每次循环可同时添加多种核苷酸，并通过对不同的荧光标记分别读取各核苷酸的荧光 fg息。
[0037] 在本发明一实施例中，所述步骤（iii)中，对所述靶向引物/模板核酸复合物进行 成像的步骤包括：
[0038] 在每个延伸循环反应中，对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前 后不同时间点进行成像。
[0039] 在本发明一实施例中，步骤（iv)的延伸反应之前的步骤（iii)中，通过全内反射 显微镜（TIRF)采集光学图像来精确定位靶向引物/模板核酸复合物所处的位置。
[0040] 在本发明一实施例中，所述的聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶或DNA聚合酶。
[0041] 在本发明一实施例中，步骤（iv)还包括对获得的延伸产物进行清洗。在本发明一 实施例中，步骤（vi)中，所述核苷酸的可断裂的基团为光可裂解的终止基团、化学断裂的 终止基团或酶催化断裂的终止基团。
[0042] 在本发明一实施例中，步骤（vi)还包括对除去光学检测标记处理后的延伸产物 进行清洗。
[0043] 在本发明一实施例中，还包括同步地对多个靶核酸测序。
[0044] 在本发明一实施例中，所述步骤（V)中，所述的对延伸后的靶向引物/模板核酸复 合物进行成像的步骤包括：
[0045] 在延伸反应后的同一时间点，对靶向引物/模板核酸复合物中的模板核酸、以及 在该延伸反应中结合到靶向引物链3'端的带光学检测标记的核苷酸进行成像。
[0046] 在本发明一实施例中，所述（v)的步骤包括：通过全内反射显微镜（TIRF)采集光 学图像来鉴定步骤（iv)引入的核苷酸种类。
[0047] 本发明提供的单分子靶向测序方法中的图像采集步骤优选采用全内反射显微系 统（TIRF)，提升信噪比。本发明提供的方法在每次步骤（iv)的延伸反应之后分别对模板核 酸和带荧光标记的核苷酸拍照；通过对同一个坐标视野的前后两次成像，纠正进行拍照时， 由于载物台的轻微移动或样品漂移产生的些许偏差。
[0048] 在本发明一实施例中，所述步骤（V)中，所述的进行图像比对和纠偏的步骤包括：
[0049] 对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前后不同时间点的成像进 行图像比对和纠偏；以及
[0050] 对该位