5'端通过氨基与基底表面的环氧键键合。在一个优选的实施方案中，靶向引物分子的5' 端顺次连接有聚胸腺嘧啶核苷酸（聚dT)的寡核酸链和烷基链（比如，-(CH2)6_)和末端氨 基，其中，聚dT寡核酸链的3'端与靶向引物分子的5'端相连，聚dT寡核酸链的5'端与烷 基链相连，烷基链通过氨基与基底表面的环氧键键合。
[0093]固定好的引物密度要求为在保证单分子级别的分散度上，尽可能的密度高一些， 这样可以保证尽可能高的测序通量。在一实施方案中，基底可以采用行业内其他处理方式， 以改善核酸附着效率。在其他实施方案中，可以对本发明中使用的基片进行处理，以降低背 景噪音。用于对基底进行修饰的环氧化物还可以为环氧化物的衍生物。
[0094]在基底固定了靶向引物之后，还需要经过化学钝化处理以消除未封闭的环氧基团 和防止测序过程中的产生的非特异性吸附带来的噪声。表面钝化处理有很多种方法，由于 测序中的荧光标记的碱基分子是负电的，在我们的具体实验中，使用磷酸盐来封闭玻璃表 面的环氧基团，并产生负电层，以减小负电性的碱基吸附。
[0095] 结合图1，本发明提供的单分子测序方法，包括：
[0096]样品制备，基底表面处理以及靶向引物（优选地，靶向引物5端包括聚胸腺嘧啶核 苷酸（聚dT)的寡核酸链）的固定，成像，和图像处理获得序列的分析步骤。
[0097]在一具体实施方案中，如图1所示，为本发明单分子测序原理示意图。测序前需要 首先将待的跟疾病相关的待测序列打断成小片段DNA模板，DNA模板的末端标记有可光学 检测的标记分子，从而通过光学显微镜进行记录和定位DNA模板的坐标；同时在基底上随 机固定多个5端包括聚dT的靶向引物；将小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确 定位，通过全内反射显微镜（TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后小片段DNA模板所处的 位置；逐次加入带有检测标记的核苷酸及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像，记录 本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的荧光分子，洗涤，加帽，准备好下一个 核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环，就可以实现实时 测序。
[0098]本发明提供的单分子测序方法采用到的聚合酶，优选为降低核酸外切酶活性的Klenow聚合酶。可选地，本发明可用核酸聚合酶包括但不限于本领域文献记载或商用的 DNA聚合酶，RNA聚合酶，逆转录酶，和/或任何上述聚合酶突变形式。
[0099] 在本发明一实施方案中，每个循环反应中，采用的带有检测标记的核苷酸为多色 核苷酸（比如，四种核苷酸分别带不同的待测标记），可同时加入同一个循环反应的反应体 系。本发明采用的核苷酸上的检测标记可选自行业内常规标记，包括但不限于：荧光素，罗 丹明，花青，Cy5,Cy3,BODIPY，Alexa及其衍生物等。
[0100] 以单分子测序为标志的第三代测序的技术，需采用循环可逆终结（cyclic reversibletermination,CRT)的办法来实现单个核苷酸的延伸以提高测序准确度。即当 某一个带有抑制基团的核苷酸加到DNA链上之后，可以阻止下一个核苷酸的延伸；在温和 条件下该抑制核苷酸可以被除去从而使该DNA链得以继续延伸。每增加一个核苷酸，可以 通过对其所带荧光的检测实现对该DNA链的实时测序。这样一个带抑制基团的核苷酸被称 作终止子（terminator)。在本发明一实施方案中，采用的带有检测标记的核苷酸为可切除 荧光标记的单色或者多色可逆末端终止子。在本发明一优选实施方案中，可逆末端终止子 为光可断裂的荧光标记可逆终端化合物。在本发明另一优选实施方案中，可逆末端终止子 为化学断裂或酶催化断裂的荧光标记可逆终端化合物。
[0101] 在一些实施方案中，至少3个，至少5个，至少10个，至少20个，至少30个，至少 50个，至少100个，至少500个，至少1000个或至少10000个连续循环反应用于延伸特异性 杂交有模板链的靶向引物，每次循环，延伸1个带荧光标记可逆终止子，每进入下一次循环 之前，带荧光标记可逆终止子去掉其荧光标记及抑制基团。
[0102] 鉴于边合成边测序的原理需要精确的温度控制和经历多次化学冲洗，测序样品被 封装在一个设计好的微流体控制系统，保证精准的温度和试剂流动。为保证测序的通量，在 本发明一优选实施方案中，可以设置多个通道。装配好的样品最终被放置在一个可观察单 分子信号的全内反射光学显微镜上面。光学信号包括荧光，拉曼，散射等。在本发明一具体 实验中，观察的光学信号是单分子的荧光信号。为防止定位信号和测序信号发生重叠，本发 明使用不同激发信号分别激发定位荧光分子和测序标记分子。在多次成像过程中，荧光分 子会发生淬灭，导致测序信号丢失和测序读长短，为改善这些问题，本发明特别关注了荧光 淬灭问题，并在成像时通过加入研发的成像试剂，缩短曝光时间，减弱激发强度等手段来保 证测序的准确性。
[0103] 在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：图像采集过程。图 像采集采用的是全内反射显微系统（TIRF)，单分子信号非常弱，TIRF系统能够显著降低背 景噪音，从而提升信噪比。本发明实施例中采用的系统为双色激光光路系统，每次采集图像 之前，需要按照化学冲洗流程对封装在微流控系统的样品进行处理，然后进行拍照，为了防 止样品漂移，定位信息需要每次延伸反应之前进行拍照，然后碱基延伸后再拍照以获得测 序信号。
[0104] 本发明提供的单分子靶向测序方法中的图像采集步骤优选采用全内反射显微系 统（TIRF)，提升信噪比。本发明提供的方法在每次步骤（iii)的延伸反应之前进行一次拍 照，然后在每次步骤（iii)的碱基延伸后再拍照一次；通过对同一个坐标视野的前后两次 成像，纠正进行拍照时，由于载物台的轻微移动或样品漂移产生的些许偏差。
[0105] 在本发明一具体实施例中，对不同时间点对同一位置拍摄的多个单分子图像的纠 偏的方法包括：
[0106] 1、首先读取第一时间点的单分子成像图片，然后再读取第二时间点的单分子成像 图片，均在matlab里面保存为uintl6格式的矩阵；
[0107] 2、对第一时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵 fft_ref；
[0108] 3、对第二时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵 fft_frame；
[0109] 4、取两个时间点图片傅里叶变换后的矩阵的卷积prod=fft_ref.*conj(fft_ frame)；
[0110] 5、对prod矩阵进行二维傅里叶反变换得到矩阵cc=ifft2 (prod);
[0111] 6、对cc这个矩阵进行fftshift变换，找到变换后矩阵最大值的坐标，再减去原始 图片大小的一半，得到的不同时间点图片的偏移量；
[0112] 7、最后再根据偏移量对第二时间点的图片用circshift函数来矫正偏移量。
[0113] 在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：图像处理过程。 在成像步骤中，每次核苷酸延伸反应所获的图像可能有几十或者上千个视野。对于图像的 处理，需要精准计算出每个反应的坐标位置并记录；在之后的每次碱基延伸过程中所获的 图像要经过图像处理软件进行位置纠偏，以校对化学冲洗过程以及样品移动造成的位置漂 移。然后再进行图像重叠，对有测序反应的位置进行逐次叠加、计算以获得每个位置的碱基 序列。
[0114] 在本发明一实施方案中，本发明提供的单分子测序方法还包括：生物信息学分析 过程。在所获得的碱基序列的基础上，通过碱基判定和比对，最终获得所测DNA片段的完整 序列。生物信息学介入以完成对该片段的生物学意义的分析，并帮助医生判断药物的选择， 疾病的筛查等。
[0115] 具体实施例
[0116] 材料及试剂说明：
[0117] 非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据 库均为公开的在线数据库。
[0118] 20xSSC:在800ml水中溶解175. 3gNaCl和88. 2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0,加水定容至1L，分装后高压灭菌。SSC是分子生物学上最为标 准的印迹及分子杂交处理液，20*SSC用于杂交实验变性及清洗常用浓缩型缓冲液。
[0119]DNA芯片固定
[0120] 如图2所示，图2为本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图。图2包括a-b， a为在环氧基玻片上固定革巴向引物DNA示意图，b为在修饰有其他基团的玻片上固定革巴向引 物的流程示意图。该技术利用了环氧基团本身不稳定，张力较大，能和修饰有_順 2的DNA发 生化学反应的优点，通过新的-CH2-NH-这个共价键将待固定的DNA单链固定在修饰有环氧 基团的芯片表面。该固定技术仅是本发明的一种具体实施例，本发明方法的优化对所有的 固定载体和DNA序列均有效。DNA序列5'端连有可以和芯片发生化学反应的基团，如氨基、 醛基、