羧基、巯基等；3'端用单分子荧光物质修饰，如Cy3、Cy5,目的在于统计固定的数目。
[0121] 具体地，本发明实施例提供了一种单分子测序方法，包括将靶向引物固定在芯片 上，具体包括如下步骤：
[0122] 1)将待固定序列的芯片用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基，基底玻片 来自于为SCHOTT公司的环氧基修饰的系列玻片）；
[0123] 2)用固定液（0. 02-0. 3MK2HP04，本实施例中采用0. 2M)将DNA稀释成浓度为 800-1600pM(本实施例中采用0. 8nM)，将芯片浸泡在DNA-固定液中45min-120min(本实施 例中采用60min)，固定液没过芯片即可；
[0124] 3)然后依次用 3xSSC+0. 1%Triton, 3xSSC, 150mMK2HP04pH= 8. 5,清洗芯片；
[0125] 4)再用pH=9. 0,0. 2-1M K2HP04(本实施例中采用1M)溶液稍稍没过芯片即可， 于室温下在摇床上以80转/分钟（r/min)摇晃15小时。
[0126] 5)依次用PBS，150mMHepes+150mMNaCl清洗芯片，最后再用双蒸水清洗芯片。
[0127] 6)通过荧光显微镜对固定好的芯片进行照相，每个芯片拍连续的20个视野，然后 统计每张照片的单分子荧光点数，计算每个视野下荧光点数的平均值。
[0128] 具体地，为观察引物尾部polyT对固定密度的影响，本发明如下DNA进行（下划线 部分为-NH2(CH2)6_)固定：
[0129]T50_Cy3(5' - 3'）：
[0130] AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT~Cv3，
[0131] 具体地，所述 ^2^ rprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprprp
[0133]为SEQUENCENO. 1 所示。
[0134]T10C50_Cy3(5' - 3'）：
[0135]AmMC6TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
[0136] 具体地，所述
[0137]TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为 SEQUENCENO. 2 所示。
[0138]C50_Cy3(5' - 3'）：
[0139]AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3
[0140] 具体地，所述
[0141]CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO. 3 所 不。
[0142]在本实施例中，将T50_Cy3、C50_Cy3、T10C50_Cy3分别固定在芯片上，按上述的固 定步骤进行操作，重复六次并统计固定上的序列数目。结果如图3所示。由图3可知，DNA由 T50-Cy3换为C50-Cy3时，固定密度会由2800降为150 ;在C50的5'端加入10bp的polyT 时，固定密度又增加至2800(经后续实验验证，10-30bppolyT，优选为10-20bppolyT均可 提高固定密度至2800左右，优选为2500-3200)，这说明DNA的5'端存在一段碱基T会大大 提高固定的密度。
[0143] 因此，本发明优选在待固定革巴向引物的5'端连接10_30bp(优选10bp)的polyT。
[0144] 具体地，为进一步观察引物尾部polyT的数量以及不同靶向引物序列对固定密度 的影响，本发明如下DNA进行（下划线部分为-NH2(CH2)6_)固定：
[0145]T10C20_Cy3(5' 一 3'）：
[0146]AmMC6TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0147] 具体地，所述
[0148]TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCEN0. 4 所示。
[0149]C20_Cy3(5' 一 3'）：
[0150]AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0151] 具体地，所述
[0152]CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCEN0. 5 所示。
[0153] T10C30_Cy3(5' -3'）：
[0154]AmMC6TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0155] 具体地，所述
[0156]TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为
[0157]SEQUENCEN0. 6 所示。
[0158] C30_Cy3(5,- 3,）：
[0159]AmMC6AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0160] 具体地，所述
[0161]AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为
[0162]SEQUENCEN0. 7 所示。
[0163]T10C40_Cy3(5' 一 3'）：
[0164]AmMC6TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0165] 具体地，所述
[0166]TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCEN0. 8 所 不。
[0167]C40_Cy3(5' 一 3'）：
[0168]AmMC6AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0169] 具体地，所述
[0170]AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCEN0. 9 所示。
[0171]T20C20_Cy3(5, - 3,）：
[0172]AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0173] 具体地，所述
[0174]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO. 10 所示。
[0175]C20_Cy3(5' 一 3'）：
[0176]AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0177] 具体地，所述
[0178]CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO. 11 所示。
[0179]T20C50_Cy3(5' - 3'）：
[0180]AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGC GATAAC-Cy3，
[0181] 具体地，所述
[0182]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATA AC为SEQUENCENO. 12 所示。
[0183]C50_Cy3(5' - 3'）：
[0184]AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC~Cv3，
[0185] 具体地，所述
[0186]CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO. 13 所 不。
[0187] 采用前述DNA芯片固定方法进行固定，实验结果显示，上述DNA均获得与 T10C50-Cy3类似的固定效果，以及"T10C50-Cy3和C50-Cy3"类似的固定规律：DNA由 polyT-(CH2)n-DNA-Cy3 换为-(CH2)n-DNA-Cy3 时，固定密度会由 2000-3500 降为 150 左右； 在-(CH2)n-的5'端加入10-30bp的polyT时，固定密度又增加至2000-3500,这说明DNA 的5'端存在一段碱基T会大大提高固定的密度。本实施方式中的部分实验结果如图3所 不。