对变形杆菌o30，o16，o20和o9特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对变形杆菌030,016,020和09血清型特异的核苷酸，尤其涉及对变形 杆菌030, 016, 020和09血清型0抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 变形杆菌属于革兰氏阴性细菌，广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物 的肠道中，对分解有机物和动物蛋白起着重要的作用，在有氧或特许条件的厌氧环境中都 具有蛋白水解酶的活性。变形杆菌为条件致病菌，多引起继发性感染，如慢性中耳炎、创伤 感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的〇抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 变形杆菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为变形杆菌菌种与株型鉴定的重 要依据，不少新菌也因此产生。对杆菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形 态的内容，核酸的相似性才是杆菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，变形杆菌的分型 与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸(包括基因组与核酸片 段）的相似性确定变形杆菌的归属。
[0005] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于变形杆菌的快速血清分型筛查，稳定的 鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式 反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵 敏、特异性强等优点。
[0006] 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备 细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部 门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为变形杆菌的防控 提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了一种对变形杆菌0抗原特异的核苷酸，其特征在于所述 的核苷酸具有： 1)SEQIDN0:1-8所示的核苷酸中的至少一种； 2) 与SEQIDN0:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种；所述的SEQIDN0:1-8 如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDN0:1-8所示的核苷酸中的至少一种。
[0009] 所述的试剂盒，还包括如下试剂：10mMdNTP30y1 ;10X酶特异性反应缓冲液 50y1 ;5U/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;引物混合物10y1 ;阳性对照品10y1 ;阴性对照品 10以1;(1(11120 51111。其中所述的？〇?引物优选为所述如3￡0 10勵:1-8所示的核苷酸中的 至少一种。
[0010] 本发明进一步公开了一种对变形杆菌0抗原特异的SEQIDN0:1-8核苷酸在制备 用于检测变形杆菌〇抗原PCR试剂盒、基因芯片或微阵列方面的应用。
[0011] 本发明所述变形杆菌可以取样于土壤、水、垃圾、腐败有机物的粗提液，或是变形 杆菌的纯培养物的粗提液等。收集变形杆菌提取基因组是采用常规方法制备获得。
[0012] 针对变形杆菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结 果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样 本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
[0013] 本发明还提供一种液相检测芯片，包括液相磁珠和连接在液相磁珠上的寡核苷酸 探针，以及相应探针所在片段所对应的相应引物；其中所述核苷酸优选为如SEQIDN0:1-8 所示的核苷酸。
[0014] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ IDNO: 1-8所示的核苷酸。
[0015]本发明进一步公开了对变形杆菌030, 016, 020和09血清型特异的核苷酸在制备 用于检测变形杆菌PCR试剂盒、检测变形杆菌的基因芯片方面、检测变形杆菌微阵列方面 的应用。所述的变形杆菌指的是检测引起食物中毒、尿路感染、风湿性关节炎、医院内感染 等多种混合型感染的细菌。
[0016]本发明公开的一种对变形杆菌0抗原特异的核苷酸与现有技术相比，本发明具有 如下优点： (1)实用性强 本发明建立的一种PCR反应体系，可检测变形杆菌，提供血清分型检测所用到的特异 引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。
[0017] (2)准确性高 本发明通过对变形杆菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的条 带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到变形杆菌所属的血清型。
[0018] (3)检测成本相对较低 可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致 病菌检测组合提供技术模式。
[0019]
【附图说明】： 图1表示本发明030血清型特异引物检测变形杆菌其他血清型标准菌株电泳结果图，rzj基因P1和P2目的条带为100bp，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图2表示本发明030血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 4株杆 菌以及1株变形杆菌、1株普罗威登斯菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本发明016血清型wzy基因P3和P4引物检测变形杆菌其他血清型标准菌 株电泳结果图，wzy基因P3和P4筛选，目的条带为157bp，其余血清型没有任何条带；具体 菌株信息见表2 ; 图4表示本发016血清型wzy基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 4株杆菌以及1株克雷伯菌、1株普罗威登斯菌，均无任何条带；具体菌株信息见表2。
[0020] 图5表示本发020血清型r幻基因P5和P6引物检测变形杆菌其他血清型标准菌 株电泳结果图，r幻基因P5和P6引物的筛选，目的条带为209bp，其余的血清型没有任何条 带，具体菌株信息见表2; 图6表示本发明020血清型r幻基因P5和P6引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 4株杆菌以及1株克雷伯菌、1株普罗威登斯菌，均无任何条带，具体菌株信息见表 2； 图7表示本发明09血清型rzj基因P7和P8引物检测变形杆菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，目的条带为158bp，其余的血清型没有任何条带。具体菌株信息见表2 图8表示本发明09血清型r幻基因P7和P8引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 4株杆菌以及1株克雷伯菌、1株普罗威登斯菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2 ; 图9表示分别用030,016,020和09特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌株 信息见表2 ; 其中：030, 016, 020和09表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳道M是2000bp laddermarker〇
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。其中变形杆菌来源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)〇
[0022] 实施例1:基_组的提取 37°C营养肉汤培养基培养变形杆菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和 10ul0. 4MEDTA重悬细胞，37°C温育 20 分钟，然 后加入10ul10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65°C温育30分钟。加等体积酚 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过1%的琼脂糖 凝胶电泳检测。
[0023] 实施例2:序列破译 提取变形杆菌各个血清型标准菌株的基因组，通过Solexa pair-end测序技术对变形 杆菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast及PSI-Blast 进行序列比对，采用TMHMM 2.0 program进行跨膜结构预测，运用ClustalW program进行 序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得变形杆菌各个血清型的〇抗原基因簇序列 及破译结果。
[0024] 实施例3:引物设计 变形杆菌各个血清型的0抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，我们选 取Blast比对结果identity和similarity值相对较低的基因特异区段设计引物。其中 030血清型的rzj基因比对结果identity值和similarity值为42%和61% ;016血清型的 叹F基因比对结果identity值和similarity值为