点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带 光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。
[0051] 在本发明一优选实施例中，对不同时间点对同一位置拍摄的多个单分子图像的比 对和纠偏的方法包括：
[0052] 1、首先读取第一时间点的单分子成像图片，然后再读取第二时间点的单分子成像 图片，均在matlab里面保存为uintl6格式的矩阵；
[0053] 2、对第一时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵 fft_ref；
[0054] 3、对第二时间点的单分子成像图片矩阵进行二维傅里叶变换，保存变换后的矩阵 fft_frame；
[0055] 4、取两个时间点图片傅里叶变换后的矩阵的卷积prod=fft_ref.*conj(fft_ frame)；
[0056] 5、对prod矩阵进行二维傅里叶反变换得到矩阵cc=ifft2 (prod);
[0057] 6、对cc这个矩阵进行fftshift变换，找到变换后矩阵最大值的坐标，再减去原始 图片大小的一半，得到的不同时间点图片的偏移量；
[0058] 7、最后再根据偏移量对第二时间点的图片用circshift函数来矫正偏移量。
[0059] 在本发明一实施例中，所述单分子靶向测序方法还包括对测序结果进行生物信息 学分析。
[0060] 第二方面，本发明提供了一种单分子靶向测序装置，包括：
[0061] 基底，用于结合一条或多条靶向引物；
[0062] 流路系统，用于可控地操控各种试剂在基底所在的芯片腔室内的进出；
[0063] 温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；
[0064] 光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；
[0065] 检测器组件，用于检测和记录荧光信号；
[0066] 计算机，具有用于控制系统以及图像处理的各个模块，其中，所述图像处理模块用 于对延伸反应前后靶向引物/模板核酸复合物的定位结果进行图像比对和纠偏，以及用于 对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测 标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。
[0067] 在本发明一实施例中，所述计算机控制的系统包括：流路系统，温控系统，光学和 检测系统。还包括数据分析软件。
[0068] 在本发明一实施例中，所述的靶向引物如第一方面任一所述的靶向引物。
[0069] 第三方面，本发明提供了一种单分子靶向测序系统，包括如第二方面所述的单分 子靶向测序装置。
[0070] 第四方面，本发明提供了一种单分子靶向测序试剂盒，包括基底、靶向引物、固定 反应试剂、延伸反应试剂、成像试剂、切除光学检测标记分子的试剂。
[0071] 可以理解的是，所述单分子靶向测序试剂盒还包括缓冲液或其他测序必要试剂。 比如，本领域技术人员根据需要分别配置针对的固定反应试剂、延伸反应试剂、切除光学检 测标记分子等不同过程的缓冲液。
[0072] 第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单分子靶向测序方法在DNA或 RNA测序中的用途。
[0073] 本发明提供的单分子靶向测序方案先在基底上随机固定多个靶向设计的引物；将 末端带有光学检测标记的小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确定位，通过全内 反射显微镜（TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后模板所处的位置；逐次加入带有可切 除光学检测标记的单色或者多色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像， 记录本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的光学检测标记，洗涤，加帽，准备 好下一个核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环，就可以 实现单分子靶向实时测序。
【附图说明】
[0074] 图1为本发明实施例提供的单分子测序原理示意图；
[0075] 图2为本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图。
[0076] 图3-6为本发明实施例提供的核酸芯片固定反应结果。
【具体实施方式】
[0077]本发明提供的单分子靶向测序装置或系统可用于对平面基底进行成像，其中基底 结合有靶向引物。在用于测序时，本发明提供的方法、装置、系统可选地包括：
[0078]基底，用于结合一条或多条靶向引物；
[0079]流路系统，用于可控地操控各种试剂（例如緩冲剂、酶、荧光标记核苷酸等）在基 底所在的芯片腔室内的进出；
[0080]温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；
[0081]光学系统，包括激光光源（例如一个或多个激光器），所述光学系统用于激发荧 光；
[0082]检测器组件（例如EMCXD相机等），用于检测和记录荧光信号；
[0083]计算机，具有用于控制系统（比如流路系统，温控系统，光学和检测系统、图像系 统。还包括数据分析软件）的各个组件。
[0084]本发明提供了如下实施例。
[0085]在本发明一实施例中，本发明提供的单分子测序技术采用了本发明提供的单分子 测序装置，包括如下步骤：将模板/引物双链与基底表面上的环氧基团共价结合；进行边测 序边合成（SBS)反应对掺入的核苷酸进行光学检测。
[0086]本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的方法可用于部分测序，DNA指纹，多 态性鉴定，例如单核苷酸多态性（SNP)的检测，以及遗传癌症研究应用。本发明的方法也可 用于RNA序列测序以确定替代剪接位点，拷贝数，检测基因表达，识别未知的细胞中以低拷 贝数存在的RNA分子。本发明的方法也可用于确定哪些序列转录来注释基因组，确定系统 发育关系，阐明细胞分化，促进组织工程。
[0087]针对不同医疗应用，通过对应的方法提取所需检测的核酸模板并进行预处理。在 本发明一实施例中，核酸模板分子包括脱氧核糖核酸（DNA)和/或核糖核酸（RNA)。核酸模 板分子可以从含有各种其它成分，如蛋白质，脂质和非模板核酸的生物样品中分离出来。核 酸模板分子可以来自动物，植物，细菌，真菌，或任何其他细胞生物体获得。本发明的生物样 品包括病毒（DNA或RNA病毒）。核酸模板分子可以直接从生物体获得的生物样品，例如从 血液，尿，脑脊髓液，精液，唾液，痰，粪便或其他组织获得。任何组织或体液样品可以用作核 酸在本发明中使用的来源。核酸模板分子也可以从培养的细胞，如原代细胞培养物或细胞 系中分离。样品还可以是从生物样品提取的总RNA或基因组DNA。
[0088] 核酸从生物样品提取后通常被打断以产生合适的片段进行分析获得的。一般而 言，随机打断为200bp左右的片段。在一个实施方案中，从生物样品中提取的核酸通过超声 处理打断。一般地，从生物样品中提取的核酸的各种技术为行业内常规技术，例如Maniatis 等人所述的《分子克隆实验室手册》，冷泉港，NY，第280-281 (1982)。通常，单个核酸模板分 子的长度可以为约5个碱基至约20kb。核酸分子可以是单链的，双链的，或双链的单链区 (例如，茎和环结构）。
[0089]靶向引物（与待测核酸片段的部分序列互补）尽可能覆盖所需待测序基因片段， 稳定高效的捕获靶向DNA片段，比如针对HBV病毒的测序，需要尽可能设计覆盖所有的基因 突变点和耐药位点的靶向引物。靶向引物一般固定在光学透明的经过修饰的基底上面。基 底表面需要经过化学修饰以便于靶向引物通过化学键或者物理吸附作用固定在基底表面。 基底为具有低的天然荧光或基本上不发荧光的任何合适的载体。
[0090] 在一个优选的实施方案中，用于本发明的基底可以是二维或三维的，并且可以包 括一个平坦表面（例如，玻璃载玻片），或者可以是其他形状。本发明的基底可以包括玻 璃（例如，可控孔度玻璃（CPG))，石英，塑料（如聚苯乙烯，不限于低交联和高交联的聚苯 乙稀），聚碳酸酯，聚丙稀和聚甲基丙稀酸甲酯（methymethacrylate)，丙稀酸共聚物，聚酰 胺，娃，金属（例如，烷基硫醇（alkanethiolate)-衍生金），纤维素，尼龙，乳胶，葡聚糖，凝 胶基质（例如，硅胶），聚丙烯醛，或复合材料。
[0091]合适的三维基底包括，例如，球，微粒，珠，膜，载玻片，平板，微机械加工的芯片，管 (例如，毛细管），微孔，微流体装置，通道，过滤器，或任何其它合适用于锚定核酸的结构。 基底可包括具有靶向引物区域的平面阵列或矩阵，比如包括核苷衍生的CPG和聚苯乙烯基 底片；衍生的磁基底片等。
[0092]靶向引物（优选地，靶向引物5'端包括聚胸腺嘧啶核苷酸（聚dT)的寡核酸链） 通过行业内常规的化学键或者物理吸附作用固定在基底表面，可以直接或间接（如通过生 物素）固定在基底表面。在一个具体实施方案中，我们使用的是经环氧硅烷处理的低荧光 玻璃表面，其表面的环氧键可以和靶向引物末端的氨基进行化学键合。在一些实施方案中， 革巴向引物分子的5'端连接聚胸腺啼啶核苷酸（聚dT)的寡核酸链的3'端，聚dT寡核酸链 的