原种事件a5547-127以及在生物样品中鉴定此类事件的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】原种事件A5547-127以及在生物样品中鉴定此类事件的方 法和试剂盒
[0001] 本申请是申请日为2006年4月4日的、发明名称为"原种事件A5547-127以 及在生物样品中鉴定此类事件的方法和试剂盒"的中国专利申请200680011600. 1 (PCT/ EP2006/003455)的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及鉴定在生物样品中存在包含特定转化事件A5547-127的植物材料，以 及包含此类事件的转基因大豆植物、植物材料和种子的方法和试剂盒。本发明的大豆植物 将除草剂耐受表型与农艺学特征、遗传稳定性和对不同遗传背景的适应性结合在一起，等 同于缺乏杂草压力的非转化大豆品系。
[0003] 发明背景
[0004] 在植物中转基因的表型表达依据基因自身结构和其在植物基因组中的位置而决 定。同时，转基因（外源DNA)存在于基因组的不同位置将以不同方式影响植物的整体表 型。在农艺学或工业上，通过基因操作向植物中成功引入商业上感兴趣的性状是一个依赖 于不同因素的漫长过程。遗传转化的植物实际上的转化和再生仅仅是一系列选择步骤的第 一步，这一系列步骤包括广泛的遗传特征鉴定、育种和田间试验的评估，最终导致原种事件 的选择。
[0005] 考虑到在新食品/饲料、GM0和非GM0产品的分离以及独有材料的鉴定方面的讨 论，对于原种事件的明确鉴定变得日益重要。理想的此类鉴定方法是既迅速又简单、不需要 很多的实验室装置。此外，该方法应该提供在没有专家解释的情况下允许明确鉴定原种事 件的结果，但是如果需要可以展示给专家详察。
[0006] 通过用包含编码耐受膦丝菌素的合成pat基因的质粒转化大豆，选择A5547-127 作为在大豆（GlycinemaxL.)发育中对抗除草剂liberty?的原种事件，并且可以作为 LibertyLink?大豆商业销售。这里描述在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的简单 和明确的方法中使用的手段。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的方法，其基于特异性识别 A5547-127的5'和/或3'侧翼序列的引物或探针。
[0009] 更具体地，本发明涉及方法，其包含扩增生物样品中存在的核酸序列，即使用至少 两种引物进行聚合酶链式反应，其中一种引物识别A5547-127的5'或3'侧翼区，另外一种 引物识别外源DNA中的序列，优选获得的DNA片段在100和500bp之间。引物可以分别识别 A5547-127的5'侧翼区内的序列（SEQID No. 1，从1-311位点）或3'侧翼区内的序列（SEQ ID No. 2从510-1880位点的互补序列）和外源DNA内的序列（SEQID No 1从312-810位 点的互补序列或SEQID No 2从1-510位点）。此处所描述的识别5'侧翼区的引物可能包 含SEQID No. 15的核苷酸序列，且识别外源DNA内序列的引物可能包含SEQID No. 13的 核苷酸序列。
[0010] 本发明更具体涉及在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的方法，其包含扩增生 物样品中存在的核酸序列，即使用分别含有SEQIDNo. 15和SEQIDNo. 13的核苷酸序列 的两种引物进行聚合酶链式反应，获得的DNA片段约为151bp。
[0011] 本发明还涉及此处描述的A5547-127的特异侧翼序列，可以用其发展在生物样品 中特异鉴别A5547-127的方法。更具体地，本发明涉及A5547-127的5'和/或3'侧翼区，可 以用其发展此处进一步描述的特异引物和探针。本发明还涉及生物样品中存在A5547-127 的鉴定方法，其基于使用此类特异引物或探针。引物可以由17到约200个连续的核苷酸序 列（选自SEQIDNo1从1-311核苷酸序列、或SEQID2从510-1880核苷酸的互补核苷酸 序列）组成，与由17到约200个连续的核苷酸序列的引物（选自SEQIDNo1从312-810 核苷酸、或SEQIDNo2从1-510核苷酸的互补序列）组合使用。引物也可以在它们的3' 末端包含这些核苷酸序列，并且引物还包含非相关序列或从所述核苷酸序列衍生而来、但 是含有错配的序列。
[0012] 本发明还涉及在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的试剂盒，所述试剂盒包括 至少一种引物或探针，其特异性识别A5547-127的5'或3'侧翼区。
[0013] 本发明的试剂盒除包含特异性识别A5547-127的5'或3'侧翼区的引物以外，可 能还包含第二种引物用于PCR鉴定方法，所述第二种引物特异性识别A5547-127的外源DNA 内的序列。优选地，本发明的试剂盒包含两种特异引物，其中一种识别A5547-127的5'侧 翼区内的序列，而其中另一种识别外源DNA内的序列。特别是识别5'侧翼区的引物可能包 含SEQIDNo. 14的核苷酸序列，并且识别转基因的引物可能包含SEQIDNo. 13的核苷酸 序列或任何此处所描述的其它引物。
[0014] 本发明还涉及在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的试剂盒，所述试剂盒包 含具有SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 15的核苷酸序列的PCR引物，用于此处所描述的 A5547-127PCR鉴定方法。
[0015] 本发明也涉及在生物样品中鉴定原种事件A5547-127的试剂盒，所述试剂盒包含 特异性探针，该探针具有与A5547-127特定区域有80%到100 %序列同一性的序列的相应 (或互补）序列。优选的探针序列相应于包含部分A5547-127的5'或3'侧翼区的特定区 域。更优选的特异性探针具有（或互补于）与SEQIDNo. 1的360到460核苷酸或SEQID No. 2的460到560核苷酸序列有80%到100%序列同一性的序列。
[0016] 本发明包括的方法和试剂盒可用于不同的目的，例如（但是并不限于）如下所示： 在植物、植物材料或产品中鉴定A5547-127的存在或缺失，其中产品是例如（但不限于）包 含植物材料的或从植物材料衍生的食物或饲料产品（新鲜的或经处理的）；另外或可选择 地，本发明的方法和试剂盒可被用于以分离转基因和非转基因材料为目的的转基因植物材 料鉴定；另外或可选择地，本发明的方法和试剂盒可被用于测定包含A5547-127的植物材 料的质量（即纯材料的百分数）。
[0017] 本发明还涉及A5547-127的5'和/或3'侧翼区，以及从A5547-127的5'和/或 3'侧翼序列发展而来的特异引物和探针。
[0018] 本发明也涉及包含原种事件A5547-127的大豆植物、其部分、细胞、种子和子代植 物。此类植物、其部分、细胞、种子和子代植物可以使用此处所描述的方法来鉴定。
[0019] 发明详述
[0020] 通常由细胞或组织的转化（或通过另外的基因操作）产生重组DNA分子掺入到植 物基因组中。掺入的特定位置是由于"随机"整合决定或在预定位置（如果使用靶向整合 方法）。
[0021] 通过用重组DNA或"转化DNA"转化植物细胞或组织而导致引入DNA到植物基因组， 且来源于此类转化DNA的DNA在下文被称为"外源DNA"，其含有一个或多个"转基因"。在 本发明中，"植物DNA"指来源于被转化植物的DNA。植物DNA通常被发现位于相应野生型植 物相同的遗传位点。外源DNA的特征在于重组DNA分子在植物基因组中掺入位点的位置和 构象。重组DNA插入植物基因组的位点也被称为"插入位点"或"靶位点"。重组DNA插入植 物基因组中可以与植物DNA的缺失联系在一起，称为"靶位缺失"。此处所使用的"侧翼区" 或"侧翼序列"指至少20bp，优选至少50bp，和直到5000bp的植物基因组序列，其位于外源 DNA邻近上游、或邻近下游，并且都与外源DNA邻接。转化过程导致外源DNA随机整合，从而 产生带有不同侧翼区的转化体，所述侧翼区对于每种转化体是特征性的且独特的。当重组 DNA通过传统杂交被引入植物中时，其在植物基因组中的插入位点、或其侧翼区通常不会被 改变。此处所使用的"插入区"指相应于至少40bp，优选至少100bp，和直到lOOOObp的区 域，包含植物基因组中外源DNA的上游和/或下游侧翼区的序列。考虑到由于物种内突变造 成的微小差别，与同种植物杂交时，插入区将保持与包含原来从转化获得的植物中外源DNA 上游和下游侧翼区序列具有至少85%、优选90%、更优选95%和最优选100%的序列同一 性。
[0022] 事件定义为（人工的）遗传位点，其由于基因工程而携带包含至少一个拷贝目的 基因的转基因。事件典型的等位基因状态为存在或缺失外源DNA。事件的表型特征在于转 基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的部分。在分子水平上，事件的特征在于 限制性酶切图谱（例如通过Southern印迹确定）、转基因的上游和/或下游侧翼序列、转基 因的分子标记的位置和/或分子构象。通常用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物 会导致多重事件，其中每个事件都是唯一的。
[0023] 此处所使用的原种事件是选自一组事件中的事件，其通过用相同的转化DNA转 化、或通过用此种转化所获得的植物回交而获得，基于转基因的表达和稳定性、及其与包含 它的植物的最适农艺学特性的相容性。因此原种事件的筛选标准为一个或多个、优选两个 或多个、有利地包含所有如下标准：
[0024] a)外源DNA的存在不会危害植物的其它所希望的特性，例如那些有关农业操作或 商业价值的特性；
[0025] b)事件的特征在于良好的确定的分子构象，其可以稳定遗传并且可以对其发展作 为鉴定对照的适当手段；
[0026] c)在事件为杂合子（或半合子）和纯合子条件下，在携带事件的植物可能暴露于 正常农业使用的环境条件范围内以商业上可接受的水平，目的基因展示正确的、适当和稳 定的时空表型表达。
[0027] 优选的外源DNA与植物基因组中的位置相关联，该位置允许基因容易的渐渗到希 望的商业遗传背景中。
[0028] 事件作为原种事件状态的确认是通过原种事件渐渗到不同相关的遗传背景中，并 且观察其依从例如上述a)、b)和c)中一个、两个或全部的标准。
[0029] 因此"原种事件"指包含外源DNA的遗传位点，其符合上述标准。植物、植物材料 或子代例如种子，在其基因组中可以包含一个或多个原种事件。
[0030]用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物、植物材料、或含有植物材料的产品的 方法基于原种事件的特定基因组特性，例如包含外源DNA的基因组区域的特异限制性酶切 图谱、分子标记或外源DNA侧翼区序列。
[0031] -旦外源DNA的一个或两个侧翼区被测序，就可经由分子生物学技术来发展特异 性识别样品中核酸（DNA或RNA)的这个（这些）序列的引物和探针。例如PCR方法可以用 于鉴定生物样品中（例如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品）的原种事件。此 类PCR基于至少两种特异性"引物"，一种识别原种事件的5'或3'侧翼区内的序列，另外一 种识别外源DNA内的序列。引物优选具有15-35个核苷酸的序列，其在最适PCR条件下分 另IJ"特异性识别"原种事件的5'或3'侧翼区内的序列和原种事件的外源DNA，以便从包含 原种事件的核酸样品中扩增出特异性片段（"整合片段"或识别的扩增子）。这表示在最佳 PCR条件下扩增的只有定向整合片段，而没有植物基因组或外源DNA的其它序列。
[0032] 适合本发明的PCR引物可能为如下：
[0033] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自5'侧翼序 列（SEQIDNo1从1到311核苷酸）的至少17个连续的核苷酸，优选20个连续的核苷酸 (识别5'侧翼序列的引物）；或者
[0034] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自3'侧翼序 列（SEQIDNo2从510到1880核苷酸的互补序列）的至少17个连续的核苷酸，优选20 个连续的核苷酸（识别3'侧翼序列的引物）；或者
[0035] -长度在17nt到约510nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自插入DNA序 列（SEQIDNo1从312到810核苷酸的互补序列）的至少17个连续的核苷酸，优选20个 连续的核苷酸（识别外源DNA的引物）；或者
[0036] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，包含选自插入DNA序列（SEQIDNo2 从1到509核苷酸）的至少17个连续的核苷酸，优选20个核苷酸。
[0037] 引物当然可以比所述的17个连续核苷酸更长，长度可以是例如20、21、30、35、50、 75、100、150、200nt或更长。引物可以完全由选自所述侧翼序列和外源DNA序列的核苷酸 序列组成。然而，引物5'末端（即在位于3'端的17个连续核苷酸之外）的核苷酸序列并 不是决定性的。因此，引物的5'序列可以由选自侧翼序列或外源DNA的核苷酸序列组成， 但是适当的可以含有一些错配（例如1、2、5、10个错配）。引物的5'序列甚至可以完全包 括与侧翼序列或外源DNA无关的核苷酸序列，例如代表限制性内切酶识别位点的核苷酸序 列。此类无关的序列或带有错配的侧翼DNA序列应该优选长度不超过100个核苷酸，更优 选不超过50个或甚至25个核苷酸。
[0038] 而且，假如所述位于3'端的17个连续核苷酸并非从外源DNA或SEQIDNo1或2 中由植物衍生序列唯一衍生而来的，那么合适的引物可能包含或由在其3'末端跨植物DNA 衍生序列和外源DNA序列（位于SEQIDNo1的311-312核苷酸和SEQIDNo2的509-510 核苷酸）之间连接区的核苷酸序列组成。
[0039] 因此，适合本发明的PCR引物也可能如下：
[0040] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自SEQ ID No 1从1到325核苷酸的至少17个连续的核苷酸序列，优选20个连续的核苷酸序列；或
[0041] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自SEQ ID No 2从495到1880核苷酸的互补序列的至少17个连续的核苷酸序列，优选20个连续的核苷 酸序列；或
[0042] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，在它们的3'末端包含选自SEQ ID No 1从295到810核苷酸的互补序列的至少17个连续的核苷酸序列，优选20个连续的核苷酸 序列；或
[0043] -长度在17nt到约300nt范围的寡核苷酸，包含选自SEQ ID No 2从1到525核 苷酸的至少17个连续的核苷酸序列，优选20个连续的核苷酸序列。
[0044] 熟练的技术人员也会立刻清楚所选的适当PCR引物对也应该不包含彼此互补的 序列。
[0045] 出于本发明的目的，"SEQ ID N〇:X代表的核苷酸序列的互补序列"所指的核苷酸 是根据Chargaff规则G'l-T; 通过用其互补的核苷酸取代，并以5'到3'方向 (即以所代表的核苷酸序列相反的方向）读码，从所代表的核苷酸序列衍生而来的核苷酸 序列。
[0046] 适当的引物的实例是SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5(识别5'侧翼序 列的引物）、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10(识别 外源DNA的