DH基因片段 PCR反应液包括 10X反应缓冲液 2.5yL，HER2(R)-F(10yM) 0.5yL，HER2(R)-R(10yM) 0. 25yL,GAPDH-F(10yM) 0. 5yL,GAPDH-R(10yM) 0. 25yL,dNTPs2.OyL, 最后用无菌超纯水将反应体系补至19. 8yL。
[0047] PCR反应液19.8yL、DNA聚合酶0.2yL、提纯的人类总RNA5.0yL，进行PCR反应， PCR反应的反应条件为：94°C，4分钟；94°C，15秒；60 °C，35秒，40个循环。扩增产物包括 HER2和GAPDH基因片段。
[0048] (2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增。
[0049] 将所得的DNA序列通过T4噬菌体DNA连接酶直接连接到pSTV28 DNA载体上， PSTV28 DNA载体购自宝生物（Takara)公司。然后将重组质粒载体转化大肠杆菌(使用北 京全式金生物技术有限公司的Trans5 a Chemically Competent Cell)，筛选阳性克隆后 提取质粒(使用天根生化科技(北京）有限公司的高纯度质粒小提试剂盒，TIANpure Mini Plasmid Kit)。对所得质粒DNA的一部分扩增产物进行测序，证明所述扩增得到的DNA片 段具有目的序列。将带有重组质粒载体转化大肠杆菌大量培养，提取质粒，紫外分光光度法 测量并计算靶基因的浓度。
[0050] (3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度（拷贝/mL)。最 后将重组质粒稀释成4个梯度（5X104拷贝/mL、5X105拷贝/mL、5X10 6拷贝/mL和5X10 7 拷贝/mL)，分别作为试剂盒的HER2/GAPDH定量标准品I、HER2/GAPDH定量标准品II、HER2/GAPDH定量标准品III、HER2/GAPDH定量标准品IV。
[0051] 将HER2/GAPDH定量标准品经梯度稀释后进行检测，如附图2所示，从左至右分别 是 2X109拷贝 /mL，2X10 8拷贝 /mL，2X10 7拷贝 /mL，2X10 6拷贝 /mL，2X10 5拷贝 /mL， 2X104拷贝/mL，2X10 3拷贝/mL，2X10 2拷贝/mL的扩增曲线。2X10 1拷贝/mL浓度检测 阴性(无3型扩增曲线)。线性范围为2\103~2\108拷贝/111匕最低检出限为2\10 3拷贝 /mL〇
[0052] 本发明所述的HER2基因扩增的检测试剂盒可用于评价乳腺癌患者是否可以用 药，HER2基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER2蛋白表达增加，导致HER2受体活化， 正确检测和评定乳腺癌的HER2基因扩增状态对指导乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重 要。赫赛汀（Here印tin，Roche)于1998年首次获批，它作为一种免疫治疗药物，能特异性 地抑制具有HER2癌基因扩增的癌细胞的生长，使病人预后大大改善。2012年6月，新的乳 腺癌革G向药物帕妥珠单抗（Perjeta，Roche)获得FDA的批准，在临床试验中，与现有标准护 理相比，帕妥珠单抗使癌症的恶化推迟了 6个月，但与赫赛汀相同，此药物也仅适用于HER2 基因扩增阳性的乳腺癌患者。因此，癌细胞J1ER2基因扩增是决定赫赛汀和帕妥珠单抗是否 有效的关键性指标。
[0053] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. HER2基因扩增的检测引物组，其特征在于，包括HER2引物组和GAPDH内参引物组，其 中 HER2引物组包括： 上游引物HER2 (R)-F :如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 下游引物HER2 (R)-R:如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列， Taqman荧光探针HER2 (R)-FP :如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列在5'端标记荧光报 告基团，除5'端标记荧光淬灭基团； GAPDH内参引物组： 上游引物GAPDH-F :如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列， 下游引物GAPDH-R :如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列， Taqman荧光探针GAPDH-FP :如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列在5'端标记荧光报告 基团，除5'端标记荧光淬灭基团。2. 根据权利要求1所述的HER2基因扩增的检测引物组，其特征在于，荧光报告基团为 6_羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹 明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥 珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3. 5、花菁5和花菁5. 5中的至少一种；荧光淬灭基团为6-羧基四 甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2和黑洞淬灭 剂3中的至少一种。 3. HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的HER2基因扩增 的检测引物组。4. 根据权利要求3所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括HER2/GAPDH 定量标准品和阴性质控品，该标准品为插入了 HER2和GAPDH基因片段的重组质粒，阴性质 控品为H20。5. 根据权利要求4所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，重组质粒的载体质 粒为T载体，标准品设5 X IO4拷贝/mL、5 X 10 5拷贝/mL、5 X 10 6拷贝/mL和5 X 10 7拷贝/ mL四个梯度浓度。6. 根据权利要求3~5任一所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括含 Mg' DNA聚合酶及dNTPs的PCR反应缓冲液。7. 根据权利要求6所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，试剂分为HER2/ GAPDH定量标准品、阴性质控品、以及HER2反应体系和GAPDH反应体系共四个独立包装的体 系，其中 HER2反应体系：10XPCR反应缓冲液2. 5yL，浓度IOyM的HER2(R)-F 0. 5yL，浓度 10 y M的HER2 (R) -R 0. 25 y L，浓度10 y M的HER2 (R) -FP 0. 5 y L，无菌超纯水将反应体系 补至 19.8yL ; GAPDH反应体系：10 X PCR反应缓冲液2. 5 y L，浓度10 y M的GAPDH-F 0. 5 y L，浓度 10 y M的GAPDH-R 0. 25 y L，浓度10 y M的GAPDH-FP 0. 5 y L，无菌超纯水将反应体系补 至 19. 8 y L。8. 权利要求3~7任一所述的HER2基因扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于，待检 样品抽提DNA后，分别使用HER2引物组和GAPDH内参引物组进行荧光定量PCR扩增，如果 检测通道没有出现S形扩增曲线，判断为HER2和GAPDH扩增阴性；如果检测通道出现S形 扩增曲线，参照以下三种标准判断： (1) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度至少一项小于I X IO3拷贝/mL，则检测 结果无效，应重新提取样本核酸进行检测； (2) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度均在I X IO3拷贝/mL~l X IO8拷贝/mL 之间，直接进行以下计算： M= HER2基因检测浓度/ GAPDH内参基因检测浓度， 当M彡0. 2时，则结果判读为：无HER2基因扩增， 当M>0. 2时，则结果判读为：HER2基因扩增； (3) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度至少一项大于I X IO8拷贝/mL，则需要 将待检样品稀释至线性范围后重新测定，并根据（2)的标准判断结果。9.根据权利要求8所述的HER2基因扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光 定量 PCR 扩增程序为：45~55°C 20 分钟；92~95°C 3~5 分钟；92~95°C 10~15 秒；55~65°C， 10~35秒，40个循环。
【专利摘要】本发明公开了HER2基因扩增的检测引物组及试剂盒，该HER2基因扩增的检测引物组，包括HER2引物组和GAPDH内参引物组，两组引物分别包括其目标基因的上下游扩增引物以及Taqman荧光探针，本发明提供的试剂盒包括该引物组以及阳性质控品和阴性质控品。利用本发明的检测引物组和试剂盒可以快速、简便地检测乳腺癌患者中HER2基因是否发生扩增，相比FISH法，具有检测灵敏度高、时间短、一般1.5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、假阳性少，适合于大规模临床开展。从而实现对HER2基因扩增快速、有效且准确的检测，保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105112522
【申请号】CN201510519851
【发明人】丁朋举, 贾哲, 王林海, 刘沛
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月21日