专利名称：一种提取哺乳动物和鸟类粪便dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。
背景技术：
近二十年，研究者广泛采用野生动物的粪便、毛发、唾液、尿液、食物残渣、卵壳、遗骸、博物馆标本等非损伤性样本获得目标物种的遗传物质，解决了许多传统采样技术难以解决的问题，促进了野生动物分子遗传学的研究。比较而言，采集野生动物的粪便具有采样方便、采样量大、不损伤动物且不受时空限制的特点，成为研究者最为青睐的采样途径。动物粪便内携带肠道脱落细胞，可用于提取目标动物的DNA。粪便成分十分复杂，还含有细菌、真菌、寄生虫、病毒及食物DNA，研究者必须通过设计特异的弓I物获取目标动物的DNA。然而，在提取粪便内目标动物的DNA时，会将酶、胆盐、胆红素、腐殖质和色素等PCR抑制物一同提取出来，这些PCR抑制物严重干扰后续的PCR反应，使得实验成本增加，试验周期拉长，甚至实验失败。这是令研究者最感棘手的问题。因此，通过粪便DNA途径进行任何动物的遗传分析时，研究者必须选择合适的粪便DNA提取方法。迄今，国内外研究者发展了多种粪便DNA提取方法，提取原理包括:(I)硫氰酸胍(GuSCN)-二氧化硅(SiO2)法；(2)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法；(3)酚-氯仿法。但是，各种提取方法的通用性不好，存在物种差异，甚至同一物种不同个体间也存在差异。再者，还发现提取方法和保存方法存在交互作用，也就是保存方法不同，提取效果也发生变化。这严重阻碍了非损伤性的粪便DNA样本运用于动物保护遗传学研究。
发明内容
本项发明旨在提供一种简便、低廉且通用有效的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。该方法可有效的克服粪便中PCR抑制物的干扰，提取的DNA浓度和纯度可以达到进一步研究的需要。本发明所提供的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法，具体包括如下步骤:(I)样品前处理:为如下A)或B):A)若待测粪便成形，则进行如下Al)或A2)Al)若所述粪便体积大于等于IXlX Icm3,且所述粪便表面有明显粘液层，如普氏野马粪便，则取所述粘液层作为待测样品；A2)若所述粪便体积小于IXlX Icm3,或所述粪便表面没有粘液层，如林麝粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；在实际应用中，所述粪便表面没有粘液层包括粪便表面粘液层不明显的情况；B)若待测粪便不成形，如鸟类粪便，具体如朱鹮粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；
(2)从步骤(I)所得待测样品中提取待纯化总DNA:为如下(a) - (d):
(a)将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液(如TNE缓冲液或PBS缓冲液)中，漩涡震荡2min，混匀后于56-600C (如60。。)温浴8_12min (如IOmin)(期间上下颠倒混匀I次)，漩涡震荡2min，使样品溶液更加均质化，从而得到样品混合液；所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液(TNE缓冲液或PBS缓冲液)的质量体积配比可为 0.3g:lmL ；在本发明的一个实施例中，所述pH8.0的缓冲液具体为TNE缓冲液。所述TNE缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下:5mM Tris, 16mM EDTA, IOOmMNaCl, pH8.0。(b)将步骤(a)得到的样品混合液以500g离心5_10min (如5min),取上清液；(c)除去步骤(b)得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液；(d)对步骤(C)得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA ；(3)对步骤(2)得到的待纯化总DNA进行纯化:为如下(I) - (II):(I)将步骤(2)得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75°C (如70°C )溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为Img:3μ I ；(II)将步骤(I)得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。在上述方法中，在步骤(2) (C)中，所述除去步骤(b)得到的上清液中的蛋白，具体可包括如下步骤:向步骤(2) (b)得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠(SDS)，于 54-580C (如 56°C)裂解 1-1.5h (如 Ih)；所述上清液、所述蛋白酶K和所述十二烷基磺酸钠的配比可为0.6mL:150μ g:15mg。在上述方法中，在步骤(2 )(d)中，所述DNA抽提采用的抽提液可为苯酚-氯仿-异戊醇和/或氯仿-异戊醇；所述苯酚-氯仿-异戊醇具体是由苯酚、氯仿和异戊醇按照体积比25:24:1的比例混合而成的混合液；所述氯仿-异戊醇具体是由氯仿和异戊醇按照体积比24:1的比例混合而成的混合液；所述DNA沉淀采用的沉淀液可为无水乙醇和/或乙酸钠水溶液。具体的，在本发明的一个实施例中，在步骤(2) (d)中，所述DNA抽提和DNA沉淀，具体包括如下步骤:al)向步骤(2) (C)得到的样品裂解液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇勻5min,以IOOOOg离心5min,回收上清液；a2)向步骤al)的上清液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇匀5min,以IOOOOg离心5min,回收上清液；a3)向步骤a2)的上清液中加入等体积的所述氯仿_异戍醇，轻轻摇勻5min,以IOOOOg离心5min,回收上清液；a4)向步骤a3)的上清液中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，以及1/10体积的乙酸钠水溶液，于_20°C放置20min，12000g离心lOmin，得到总DNA沉淀；所述乙酸钠水溶液的pH为5.2， 乙酸钠的浓度为3M ；a5)将步骤a4)得到的总DNA沉淀用70%乙醇洗涤一遍，干燥后得到所述待纯化总DNA。在上述方法中，在步骤(3) (I)中，所述溶胶液具体是浓度为5M的碘化钠水溶液。在上述方法中，在步骤(3) (II)中，所述DNA纯化，具体包括如下步骤:bl)将步骤(I)得到的待过柱样品液加到所述硅胶膜DNA吸附柱中，12000g离心lmin,向柱内加入500 μ I的70% (体积分数)乙醇，以12000g离心lmin，重复加入500 μ I的70% (体积分数)乙醇，再以12000g离心Imin ；b2)将柱子转移至1.5mL离心管中，开盖放置2min,向柱子膜中央部位加入100 μ 160°C预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心lmin，得到所述纯化后的总DNA样品。在本发明的一个实施例中，所述娃胶膜DNA吸附柱具体为Epoch Life Science公司产品，其产品目录号为1920-050。所述TE缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下:10mMTris,ImM EDTA，ρΗ8.0。在上述方法中，在步骤(2)和步骤(3)之间还包括如下步骤:向步骤(2)得到的待纯化总DNA (干燥后的DNA沉淀)中加入100 μ L的所述TE缓冲液，并置于56°C溶解l_5min(如 5min)。本发明的再一个目的是提供一种 从动物粪便中提取总DNA的方法。本发明所提供的从动物粪便中提取总DNA的方法，具体包括上述从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法的步骤(I)和步骤(2)。本发明的还一个目的是提供一种从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法。本发明所提供的从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法，具体包括上述从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法的步骤(I)和步骤(3)。在本发明中，以上所有的所述动物均可为哺乳动物或鸟类。本发明与已报道的粪便DNA提取方法相比，本发明根据不同粪便类型，选择了不同的预处理方法(步骤(I))。通过梯度离心方法使粪便残渣和肠道脱落细胞得已有效分离(步骤(2)中的(b))，并增加了温浴(步骤(2)中的(a))，使脱落细胞更易从粪渣中析出，最大限度提高脱落细胞的含量。另外，本发明在提取到粪便DNA后，还增加了粪便DNA纯化过程(步骤(3))，是通过切胶-溶胶-硅胶膜胶回收实现的。实验证明本发明所提取和纯化的DNA片段长度大于23Kbp，浓度平均值大于9 μ g/ml, 1.8彡0D260/280 < 2.0，这表明本发明所得到的粪便DNA可以进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。再则，本发明整个提取和纯化过程，不需要高端精密的仪器，成本低廉，试验周期短，且操作简单，一般实验人员均可掌握。本发明所提供的粪便DNA提取和纯化方法，具有良好的通用性，适用于哺乳动物和鸟类的粪便DNA提取，并已在普氏野马(Equus Przewalskii)、平原斑马(Equusquagga)、蒙古野驴(Equus hemionus)、白犀牛(Ceratotherium simum)、野胳马它(Camelusbactrianus)、赛加玲羊(Saiga tatarica)、长颈鹿(Giraffa Camelopardalis)、麋鹿(Elaphurus davidianus)(Moschus berezovskii)、原磨(Moschus moschiferus)、狼(Canis lupus)、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)、金丝猴(Rhinopithecusroxellanae)、朱鹤(Nipponia nippon)、褐马鸡(Crossoptilon mantchuricum)、丹顶鹤(Grus japonensis)等哺乳动物和鸟类中得到验证。本发明方法一次可提取到大量的DNA,尤其适用于诸如采用多引物的微卫星标记的相关研究，无须多次提取DNA。在验证的本方法提取的粪便DNA还能用作核功能性DNA的扩增，如MHC基因家族相关基因的扩增。还能用于性别鉴定基因的模板，成功鉴定林麝和朱鹮的性别。作为扩增线粒体DNA的模板，效果尤其优越，如对线粒体控制区片段、12SrRNA的扩增。
图1为从普氏野马粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1-4为普氏野马粪便DNA ;泳道M为λ DNA/HindIII Marker。图2为以普氏野马粪便DNA为模板扩增微卫星琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_10依次为普氏野马个体I在微卫星位点VHL20，HTG4，HTGlO，HMS3, ASB2, CA425, HMS6, HMS7, AHT4, AHT5 上的 PCR 产物；泳道 11-20 依次为普氏野马个体 2 在微卫星位点 VHL20，HTG4, HTG10, HMS3, ASB2, CA425, HMS6, HMS7, AHT4, AHT5 上的PCR产物。图3为以普氏野马粪便为研究对象，本发明方法和国产粪便DNA提取试剂盒在微卫星位点上的PCR成功率统计结果。其中，I表示以国产粪便DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号:DP328)提取的粪便DNA作为模板；2表示以本发明方法提取的粪便DNA作为模板。图4为以普氏野马粪便DNA为模板扩增MHC基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_4为以3 μ I从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA原液为模板时的PCR产物；泳道5-8为以3μ I从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA的2倍稀释液为模板时的PCR产物。图5为以普氏野马粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_4为在马线粒体控制区的PCR产物，N为阴性对照。图6为从林麝粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1-4为林麝粪便DNA ;泳道M为λ DNA/HindlHMarker。图7为以林麝粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_9为在林麝线粒体控制区的PCR产物。图8为以林麝粪便DNA为模板扩增线粒体DNA的CYTB基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_5为在林麝线粒体CYTB基因的PCR产物。
图9为从朱鹮粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1_4为朱鹮粪便DNA ;泳道M为λ DNA/HindIII Marker。图10为以朱鹮粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ;泳道1_4为在朱鹮线粒体控制区的PCR产物，N为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
TNE 缓冲液:5mM Tris, 16mM EDTA, IOOmM NaCl，ρΗ8.0。
TE 缓冲液:10mM Tris, ImM EDTA，pH=8.0。
溶胶液:终浓度为5M的NaI水溶液。
硅胶膜DNA吸附柱:Epoch Life Science公司产品，其产品目录号为1920-050
实施例1、普氏野马粪便DNA的提取及鉴定
一、普氏野马粪便DNA的提取
I)由于普氏野马粪 便成形，体积大于IXlXlcm3,且粪便表面有粘液层，所以以其粘液层作为待测样品。用镊子从粪便表面刮取0.3g，转移至2mL离心管中，加入ImL TNE缓冲液，于漩涡震荡器上剧烈震荡2min。
2)置于60°C水浴中温浴lOmin，期间上下颠倒离心管混匀I次，使待测样品与TNE缓冲液混合更加均匀。
3)再于镟润震荡器剧烈震荡2min,以500g离心5min (使粪洛沉降于离心管底部，使脱落细胞悬浮于上清液中，使两者有效分离)，吸取0.6mL上清液转移至2.0mL离心管中。
4)向上述装有上清液的2mL离心管中，加入15yL蛋白酶K (10mg/mL)和150yL10% (10g/100ml)十二烷基磺酸钠(SDS)，56°C水浴裂解lh，期间每隔20min摇勻I次。
5)向上述上裂解液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液(体积比为25:24:1),轻轻摇勻5min,以IOOOOg离心5min。取上清液于2mL离心管中，然后再加入等体积的所述苯酹-氯仿-异戍醇抽提液，摇勻5min,以IOOOOg离心5min。最后取上清液于2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(体积比为24:1)，轻轻摇匀5min，以IOOOOg离心5min,取上清液。
6)将上述上清液转移至1.5mL离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，并加入上清液十分之一体积的乙酸钠水溶液(3M，pH5.2)。在_20°C冰箱中放置20min。
7) 12000g离心lOmin，弃去上清液，收集离心管底部的DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤一遍，置于通风橱内风干乙醇。
8)向干燥后的DNA中加入100 μ L的TE缓冲液，置于56°C水浴溶解5min。
9)溶解后的DNA经过0.8%琼脂糖凝胶电泳，根据λ DNA/HindlIIMarker,切下含有基因组DNA的胶块区域，加入胶块质量3倍体积的溶胶液(即所述胶块与所述溶胶液的配比为Img:3μ 1)，于70°C水浴溶胶。
10)胶块溶解完全的溶液转移至硅胶膜DNA吸附柱，12000g离心lmin。向柱子内加入500 μ I的70% (体积分数)乙醇，以12000g离心lmin。重复加入500 μ I的70% (体积分数)乙醇,再以12000g离心lmin。
11)将柱子转移至1.5mL离心管中，并敞开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入60°C预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心lmin，最终获得纯化后的总DNA。
二、普氏野马粪便DNA的鉴定
1、紫外吸收
将步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA，利用分光光度仪进行紫外吸收测定，共测定4个平行样品，每个样品重复测定三次，结果取平均值。
结果如表I所示，可见步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA，其浓度平均值为17.69±2.1 μ g/ml，0D260/280为1.86±0.03，这说明步骤一提取并纯化后的总DNA纯度较高，基本上无蛋白和RNA，可进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。
表I从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA的紫外吸收分析结果
权利要求
1.一种从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法，包括如下步骤: (1)样品前处理:为如下A)或B): A)若待测粪便成形，则进行如下Al)或A2): Al)若所述粪便体积大于等于IXlX Icm3,且所述粪便表面有粘液层，则取所述粘液层作为待测样品； A2)若所述粪便体积小于IXlX Icm3,或所述粪便表面没有粘液层，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品； B)若待测粪便不成形，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品； (2)从步骤(I)所得待测样品中提取待纯化总DNA:为如下(a) - (d): (a)将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液中，混匀后于56-60°C保温8-12min，得到样品混合液； 所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液的配比为0.3g:lmL ； (b)将步骤(a)得到的样品混合液以500g离心5-10min，取上清液； (c)除去步骤(b) 得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液； Cd)对步骤(c)得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA ； (3)对步骤(2)得到的待纯化总DNA进行纯化:为如下(I)- (II): (I)将步骤(2)得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75°C溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为Img:3μ I ； (II)将步骤(I)得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在步骤(2)(c)中，所述除去步骤(b)得到的上清液中的蛋白，包括如下步骤:向步骤(2) (b)得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，于54-58 °C裂解1-1.5h ; 所述上清液、所述蛋白酶K和所述十二烧基磺酸钠的配比为0.6mL:150 μ g:15mg。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:在步骤(2)(d)中，所述DNA抽提采用的抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇和/或氯仿-异戊醇；所述苯酚-氯仿-异戊醇是由苯酚、氯仿和异戊醇按照体积比25:24:1的比例混合而成的混合液；所述氯仿-异戊醇是由氯仿和异戊醇按照体积比24:1的比例混合而成的混合液；所述DNA沉淀采用的沉淀液为无水乙醇和/或乙酸钠水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:在步骤(2)(d)中，所述DNA抽提和DNA沉淀,包括如下步骤: al)向步骤(2) (c)得到的样品裂解液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混勻，以IOOOOg离心5min,回收上清液； a2)向步骤al)的上清液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混匀，以IOOOOg离心5min,回收上清液； a3)向步骤a2)的上清液中加入等体积的所述氯仿-异戍醇，混勻，以IOOOOg离心5min,回收上清液； a4)向步骤a3)的上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，以及1/10体积的乙酸钠水溶液，于-20°C放置20min, 12000g离心IOmin,得到总DNA沉淀； 所述乙酸钠水溶液的PH为5.2，乙酸钠的浓度为3M ； a5)将步骤a4)得到的总DNA沉淀用70%乙醇洗涤一遍，干燥后得到所述待纯化总DNA。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:在步骤(3)(I)中，所述溶胶液是浓度为5M的碘化钠水溶液。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在步骤(3)(II)中，所述DNA纯化，包括如下步骤: bl)将步骤(I)得到的待过柱样品液加到所述硅胶膜DNA吸附柱中，12000g离心lmin，向柱内加入500 μ I的70%乙醇，以12000g离心lmin，重复加入500 μ I的70%乙醇，再以12000g 离心 Imin ； b2)将柱子转移至1.5mL离心管中，开盖放置2min,向柱子膜中央部位加入100 μ 160°C预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心lmin，得到所述纯化后的总DNA样品。
7.一种从动物粪便中提取总DNA的方法，其特征在于:所述方法包括权利要求1-6任一中的步骤(I)和步骤(2)。
8.一种从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法，其特征在于:所述方法包括权利要求1-6任一中的步骤(I)和步骤(3)。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述动物为哺乳动物或鸟类。
全文摘要
本发明公开了一种从哺乳动物和鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。该方法包括如下步骤1)前处理若粪便成形，体积大于等于1×1×1cm3，且表面有粘液层，则以粘液层为待测样品；其余以粪便为待测样品；2)提取将待测样品置于pH8.0的缓冲液中，混匀后于56-60℃保温8-12min；500g离心5-10min，取上清；除蛋白；进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；3)纯化将待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含待纯化总DNA的胶块，加入溶胶液，于65-75℃溶胶，溶胶后样品加入硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。本发明对不同类型粪便进行不同预处理；通过梯度离心使粪渣和肠道脱落细胞有效分离；增加温浴，使脱落细胞更易从粪渣中析出，最大限度提高细胞含量。
文档编号C12N15/10GK103146683SQ20131005348
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月19日 优先权日2013年2月19日
发明者刘刚, 胡德夫, 刘宝庆, 李林海, 徐超群 申请人:北京林业大学