专利名称：普氏原羚粪便dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及普氏原羚粪便DNA的提取方法，特别适用于普氏原羚的DNA分析，也可用于普氏原羚种群分析、个体识别和数量调查等领域。
背景技术：
普氏原羚被国际自然和自然资源保护联盟(IUCN)列为濒危级，属于国家一级重点保护野生动物，国内野生普氏原羚数量很少，种群数量在300只左右。普氏原羚的种群数量虽有增加趋势，但由于草场围栏，使得普氏原羚栖息地变得支离破碎，生存环境不断恶化。现在普氏原羚种群已被分隔成几个小的孤立种群，而且它们之间没有生境走廊，这使得它们可能近交，从而造成遗传上的近交衰退，加上遗传漂变，使得普氏原羚部分个体适应性严重下降，从而使得整个普氏原羚物种的种群生存力严重下降。
为了便于对普氏原羚进行遗传学研究，特别是进行普氏原羚的遗传多样性、个体识别和亲子鉴定和数量调查等的研究，为普氏原羚种群的保护提供遗传学依据，需要提取普氏原羚得DNA样品。
为从动物身上非损伤性提取DNA，《东北林业大学学报》第28卷第7期第72-77页、《遗传》第23卷第3期第217-219页、《山东畜牧兽医》1999年第2期第1-2页以及中国专利97107478等曾分别提出了从朱、大熊猫等动物毛发提取DNA的方法，进行动物的种群分析、性别鉴定等。这些方法需要捕获或直接接触动物体，材料的获得自然存在一定的难度。所以这些方法在一些特定动物物种或对象研究领域中会有一些局限。《动物学报》2003年第49卷第5期第670-674页、《经济动物学报》2003年第7卷第1期第32-34页则提出了从从大熊猫粪便提取DNA的方法。国外一些学术期刊也发表了一些从动物粪便提取DNA的方法，如《Molecular Ecology》1997年6卷225-234页、483-486页、1091-1097页以及《Nucleic Acids Research》1995年6卷225-234页23卷18期3800-3801页。
普氏原羚奔跑速度快，不易捕逮，一般的DNA提取材料很难获得，而其粪便的获得则容易得多。然而，由于普氏原羚粪便中含有的生化物质如有些特定的抑制物质与其他动物不同，因此普氏原羚粪便DNA提取方法也不同于其他动物。本发明以普氏原羚的粪便为材料，利用常规的生化试剂，从中提取DNA，用于普氏原羚的种群分析和个体识别等研究。
发明内容
为了对普氏原羚进行DNA分析，本发明提供了一种普氏原羚粪便DNA的提取方法。
该方法是利用常规的生化试剂，经过溶解、离心、沉淀和干燥后，低成本地从粪便中获得高质量的DNA。具体技术方案是取0.2克低温保存的粪便悬浮于2ml 0.8％的生理盐水，4℃低速离心5分钟，取上清得到溶液A；向A中加溶菌酶，室温放置5-7分钟，中速离心5分钟，取沉淀得到B；向B中加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)和蛋白酶K，得到溶液C；55℃的水浴3.5-4小时；然后对溶液C进行2次抽提第一次在C中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液D，第二次在D中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液E，在E中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心15分钟后获得DNA样品F；最后用70％的冰乙醇洗涤F两次，真空干燥F后溶于适量的缓冲液中于-20℃保存。
具体实施例方式
本方法具体实施方式
是取0.2克低温保存的粪便悬浮于2ml 0.8％的生理盐水，4℃低速离心5分钟，取上清得到溶液A；向A中加溶菌酶，室温放置5-7分钟，中速离心5分钟，取沉淀得到B；向B中加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)和蛋白酶K，得到溶液C；55℃的水浴3.5-4小时；然后对溶液C进行2次抽提第一次在C中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液D，第二次在D中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液E，在E中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心15分钟后获得DNA样品F；最后用70％的冰乙醇洗涤F两次，真空干燥F后溶于适量的缓冲液中于-20℃保存。
权利要求
1.普氏原羚粪便DNA的提取方法，其特征是取0.2克低温保存的粪便悬浮于2ml 0.8％的生理盐水，4℃低速离心5分钟，取上清得到溶液A；向A中加溶菌酶，室温放置5-7分钟，中速离心5分钟，取沉淀得到B；向B中加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)和蛋白酶K，得到溶液C；55℃的水浴3.5-4小时；然后对溶液C进行2次抽提第一次在C中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液D，第二次在D中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液E，在E中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心15分钟后获得DNA样品F；最后用70％的冰乙醇洗涤F两次，真空干燥F后溶于适量的缓冲液中于-20℃保存。
全文摘要
普氏原羚粪便DNA的提取方法取少许粪便悬浮于生理盐水，在离心后的上清液A中加入溶菌酶，中速离心取沉淀B；向B中加入含SDS和蛋白酶K的Tris－HCl、EDTA、NaCl的混合液，得到溶液C；55℃的水浴3.5－4小时；然后对溶液C进行2次抽提获得DNA样品F；最后用70％的冰乙醇洗涤F 2次，真空干燥F后溶于适量的缓冲液中于－20℃保存。
文档编号C12N15/10GK1718728SQ20041006272
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者李迪强, 洪艳芸 申请人:李迪强, 洪艳芸