一种倭蜂猴粪便dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，取-20℃冷冻保存的粪便，加入1ml无水乙醇，振荡混匀，倾去上清液，重复3-5次至上清无异色；加1ml无菌双蒸水混匀，倾去上清液，重复3-5次至上清无异色；加500ul1％SDS水浴10min；离心5min；转移上清液；加等体积的酚25：氯仿24：异戊醇1；取上清液，加醋酸钠、无水乙醇，-20℃放置20min，沉淀DNA，倾去上清，加酒精洗涤DNA，离心，室温下自然晾干，加适量无菌双蒸水，-20℃保存。本发明具有提取DNA分子量大，成功率高的特点，适合推广应用。
【专利说明】—种倭蜂猴粪便DNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种DNA提取方法，具体地说，涉及一种倭蜂猴粪便DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中，本【技术领域】最接近的参考文献:张宝卫，魏辅文，李明等.大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法[J].动物学报，2004，50 (3):452— 458.文献方法如下:
[0003](1)通过重复离心，从保存的粪便样品中转移200_300mg入2ml灭菌的离心管中。
[0004](2)加入1ml乙醇,振荡15s混匀,10000r/min离心3min,倾去上清;重复此步骤至上清
[0005]无异色。
[0006](3)加入1ml双蒸水，振荡混匀，10000r/min离心3min,倾去上清；重复此步骤1次。
[0007](4)加入500ulL 0%SDS,振荡混匀，置于55°C水浴IOmin,其间每3_4min取出混匀一次。
[0008](5)取出离心管，10000r/min离心5min后，吸取上清液450ul至一新的2ml离心管中。
[0009](6)加入30ul0.5molEDTA, 20mg/ml的蛋白酶K20ul,振荡混匀，55 V水浴消化
0.5-lh。
[0010](7)取出离心管，加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，抽提lOmin。
[0011](8) 10000r/min 离心 lOmin,取出离心管。
[0012](9)吸取450ul上清液至一新的2ml离心管中，加入45ul3mol的醋酸钠，Iml乙醇，混匀后_20°C放置20min。
[0013](10) 12000r/min离心10min沉淀DNA,倾去上清，室温中晾干。
[0014](11)加入IOOul双蒸水，冰上静置，溶解管底部的DNA。
[0015](12)使用 PCR产物纯化试剂盒 E.Z.N.A.Cycle-pureKit (USA, Omega 公司)纯化溶解的模板，纯化产物用50ul超纯水洗脱。电泳检测后，_20°C保存。
[0016]文献方法缺陷:提取DNA分子量小，降解程度高，PCR成功率低。
【发明内容】
[0017]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，该方法提取DNA分子量大,成功率闻。其技术方案如下:
[0018]一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，包括以下步骤:
[0019]①称取0.05g-0.1Og在_20°C下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入Iml无水乙醇,振荡混匀lmin, 4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3_5次至上清无异色；[0020]②加入1ml无菌双蒸水混匀，4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3-5次
至上清无异色；
[0021]③加入500ull% SDS，振荡混匀，55°C水浴lOmin，其间每3_4min取出混匀；
[0022]④取出离心管，4°C10000r/min 离心 5min ；
[0023]⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA, 20mg/ml的蛋白酶KlOul，振荡混匀，55°C水浴消化30min-lh ；
[0024]⑥取出离心管加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，于10000r/min条件下抽提lOmin，取上清液；重复抽提2-3次；
[0025]⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，Iml无水乙醇，-20°C放置20min，4°C 12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入适量无菌双蒸水，_20°C保存。
[0026]本发明的有益效果:本发明提取DNA分子量大，降解较少，PCR的成功率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是依照现有技术文献方法提取粪便DNA的电泳图；
[0028]图2是本发明方法提取粪便DNA的电泳图；
[0029]图3是两种方法提取粪便DNA分子量图；
[0030]图4是两种方法提取粪便DNA进行PCR成功率的图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0032]实施例1
[0033]一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，包括以下步骤:
[0034]①称取0.05g在_20°C下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀lmin,4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3次至上清无异色；
[0035]②加入1ml无菌双蒸水混匀，4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3次至
上清无异色；
[0036]③加入500ull% SDS，振荡混匀，55°C水浴lOmin，其间每3min取出混匀；
[0037]④取出离心管，4°C10000r/min 离心 5min ；
[0038]⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA, 20mg/ml的蛋白酶KlOul，振荡混匀，55°C水浴消化30min ；
[0039]⑥取出离心管加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，于10000r/min条件下抽提lOmin，取上清液；重复抽提2次；
[0040]⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，Iml无水乙醇，-20°C放置20min，4°C 12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入无菌双蒸水，_20°C保存。
[0041]实施例2[0042]一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，包括以下步骤:
[0043]①取0.07g在_20°C下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀lmin,4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复4次至上清无异色；
[0044]②加入1ml无菌双蒸水混匀，4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复4次至
上清无异色；
[0045]③加入500ull% SDS，振荡混匀，55°C水浴lOmin，其间每4min取出混匀；
[0046]④取出离心管，4°C10000r/min 离心 5min ；
[0047]⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA, 20mg/ml的蛋白酶KlOul，振荡混匀，55°C水浴消化45min ；
[0048]⑥取出离心管加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，于10000r/min条件下抽提lOmin，取上清液；重复抽提3次；[0049]⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，Iml无水乙醇，-20°C放置20min，4°C 12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入无菌双蒸水，_20°C保存。
[0050]实施例3
[0051]一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0052]①称取0.1Og在_20°C下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀lmin,4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复5次至上清无异色；
[0053]②加入1ml无菌双蒸水混匀，4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复5次至
上清无异色；
[0054]③加入500ull% SDS，振荡混匀，55°C水浴lOmin，其间每4min取出混匀；
[0055]④取出离心管，4°C10000r/min 离心 5min ；
[0056]⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA, 20mg/ml的蛋白酶KlOul，振荡混匀，55°C水浴消化Ih ；
[0057]⑥取出离心管加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，于10000r/min条件下抽提lOmin，取上清液；重复抽提3次；
[0058]⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，Iml无水乙醇，-20°C放置20min，4°C 12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入无菌双蒸水，_20°C保存。
[0059]实施例4文献方法与本发明改进方法的效果对比
[0060]倭蜂猴粪便DNA提取方法依据张宝卫等(2005)提出的用酒精和双蒸水洗涤粪便可以除去抑制物，并作出一定改进。
[0061]参考文献:张宝卫，魏辅文，李明等.大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法[J].动物学报，2004，50 (3) =452—458.[0062]具体实验结果:从图1和2中可以明显看出，改进方法倭蜂猴粪便DNA大部分都是2000bp以上的较长DNA片段，降解较少，而依照文献方法从粪便中提取的DNA都有拖尾现
象，存在一定程度的降解。[0063]从图3中可以明显看出，改进方法提取DNA分子量明显大于文献方法。
[0064]从图4中可以明显看出，改进方法提取DNA进行PCR的成功率明显大于文献方法。
[0065]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤: ①称取0.05g-0.1Og在-20°C下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀lmin, 4°C 10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3_5次至上清无异色； ②加入1ml无菌双蒸水混匀，4°C10000r/min离心3min,倾去上清液,重复3_5次至上清无异色； ③加入500ull%SDS，振荡混匀，55°C水浴lOmin，其间每3_4min取出混匀； ④取出离心管，4°C10000r/min离心5min ； ⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA, 20mg/ml的蛋白酶KlOul，振荡混匀，55°C水浴消化30min-lh ； ⑥取出离心管加入等体积的酚25:氯仿24:异戊醇1，于10000r/min条件下抽提lOmin，取上清液；重复抽提2-3次； ⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，Iml无水乙醇，-20°C放置20min ，4°C 12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入无菌双蒸水，_20°C保存。
【文档编号】C12N15/10GK103911370SQ201410145177
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】王政昆, 朱万龙, 张 浩, 高文荣, 章迪, 沐远 申请人:云南师范大学