与水牛产奶性状相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了与水牛产奶性状相关的SNP标记及其应用。所述SNP标记位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其中在SEQ?ID?NO：1的第886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp和5540bp处的G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393和C5540-T5540的碱基突变，均与水牛产奶量显著相关（p<0.05）；第1386bp处的A1386-G1386的碱基突变则与水牛产奶量极显著相关（p<0.01）。本发明为水牛产奶性状的标记辅助选择提供了科学依据。
【专利说明】与水牛产奶性状相关的SNP标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及与水牛产奶性状相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002]据FA02013年的统计数据显示，2011年底水牛存栏量为2338.2万头，仅次于印度11291.6万头和巴基斯坦3172.6万头，位居世界第三，可谓资源丰富。中国水牛属于沼泽型品种，具有耐粗饲、役力大、耐湿、耐高温、抗病力强等生物学特点，是我国南方地区重要的畜种，其资源丰富，奶质优良，营养丰富，具有“奶中之王”之美称。但我国水牛产奶量较低，其泌乳性能远低于世界著名的三大河流型水牛品种(摩拉、尼里-拉菲和地中海水牛)。为提升本地水牛的泌乳性能，我国自上世纪50年代和70年代分别从印度和巴基斯坦引进摩拉和尼里-拉菲水牛加以改良，并取得了较大的成效。尽管其产奶量得到了较大的提高，但仍存在着明显的差异。因此，利用先进的分子标记辅助选择技术应用于优良的奶水牛品种选育，对于改善水牛种质资源的创新与利用，尤其是有效的提高选种效率具有重要的意义。
[0003]泌乳主要来源于水牛的乳腺，受多种因素的影响，涉及乳腺发育和泌乳相关的基因、代谢通路以及细胞因子等。水牛的产奶性状与其他家畜的经济性状一样，同属于数量性状，由微效多基因控制。其中脂类代谢与其产奶量和乳品质相关。甘油三脂是乳脂和体脂的主要成分，溶血憐脂酸酸基转移酶(lysophosphatitidic acid acy I transferase, LPAAT )可催化甘油三酯sn-2位置的酯化，催化溶血磷脂酸形成磷脂酸。而磷脂酸是甘油三酸脂及重要脂类分子信号生物合成的关键底物。显然，LPAAT的生物学功能与水牛的产奶量和乳品质具有重要的相关性 。
[0004]迄今为止，尚无有关水牛LPAAT基因作为水牛产奶性状的分子标记。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于围绕我国水牛品种产奶量较低的问题，提供一种应用于选育水牛产奶性状相关基因LPAAT。
[0006]本发明另一目的是提供上述一种水牛产奶性状相关基因LPAAT SNP的筛选。
[0007]本发明还有一个目的是提供上述水牛产奶性状相关基因LPAAT SNP的应用。
[0008]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0009]1.与水牛产奶性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]上述LPAAT 序列的第 886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp 和 5540bp 处的G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393 和 C5540-T5540 的碱基突变，均与水牛产奶量显著相关(P〈0.05);第1386bp处的A1386-G1386的碱基突变则与水牛产奶量极显著相关(P〈0.01)。
[0011]2.水牛产奶性状相关基因LPAAT的获取方法，包括如下步骤:[0012](1)取I头水牛静脉血并提取其总DNA。
[0013](2)参考牛 LPAAT 基因(GenBank:AF285100.1)，利用 Primer5.0 引物设计软件，经Oligo软件检测，确定用于扩增水牛LPAAT基因的正方向引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成。
[0014](3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果。
[0015]PCR反应扩增程序为:
[0016]
【权利要求】
1.与水牛产奶性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的LPAAT基因，其特征在于:在SEQID NO:1的第886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp 和 5540bp 处的 G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393和C5540-T5540的碱基突变，均与水牛产奶量显著相关；第1386bp处的A1386-G1386的碱基突变则与水牛产奶量极显著相关。
3.权利要求1所述水牛产奶性状相关基因LPAAT基因的获取方法，其特征在于按照以下步骤: (1)取I头水牛静脉血并提取其总DNA； (2)以水牛LPAAT基因序列为模板，利用Primer5.0软件设计引物，经Oligo软件检测，确定用于扩增水牛LPAAT基因的正方向引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成； (3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果；PCR反应扩增程序为:940C /3min ；94°C /lmin, 60°C /30sec, 72°C /lmin, 31 个循环；72°C延伸 /lOmin ； 用1.5%含GoldView琼脂糖凝胶电泳对5 μ L PCR扩增产物进行检测，所述电泳条件为电压5V/cm，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带，将剩余的扩增产物委托深圳华大科技有限公司测序； (4)将扩增产物克隆至PMD-18T，挑取阳性克隆委托深圳华大科技有限公司测序，结合生物信息学分析获取水牛LPAAT基因核苷酸序列。
4.权利要求1所述水牛产奶性状相关基因LPAAT分子标记的筛选，其特征在于按照以下步骤: (O根据水牛家族系谱和产奶记录，选取5头高产水牛，产奶量为305d大于或等于2000kg,以及5头低产水牛，产奶量为305d小于或等于1000kg，对其静脉采血并提取总DNA ； (2)根据水牛LPAAT基因序列设计引物，其序列如SEQID NO:17所示，对上述10头水牛DNA样品进行PCR扩增，取5 μ L PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余样品委托深圳华大科技有限公司测序； (3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析软件对测序结果进行拼接和比对，获取候选的SNP位点，其中有18个位点发生突变，即12个位于5’ UTR，而内含子2有3个，内含子5有2个，外显子4有1个。
5.所述的分子标记在水牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，包括如下步骤: (1)对393头水牛进行静脉采血提取总DNA，对其进行质控，调整DNA终浓度在30-50ng/y L 之间； (2)针对权利要求4所筛选的SNP候选位点，利用SequenomMassARRAY技术对上述水牛DNA样本进行SNP分型检测，根据质谱峰图判读各样本位点基因型； (3)利用SAS9.2软件开展SNP基因分型检测结果与水牛产奶量的相关性分析。
【文档编号】C12N15/11GK103898106SQ201410145150
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】邓廷贤, 梁贤威, 庞春英, 杨炳壮, 陈明棠, 黄健, 谭正准, 李辉 申请人:广西壮族自治区水牛研究所