利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置的制作方法

专利名称：利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域涉及提高细胞培养效率的方法及装置。所述方法和装置利用用于气体交换的透气性材料，可增加用于细胞培养的培养基的高度，降低透气装置的表面积与培养基体积容量的比例，并且整合了传统的细胞支持支架。所述方法及装置具有多种益处，包括更有效地使用了库存空间、培养箱空间、处置空间和劳力以及降低了污染风险。
背景技术：
细胞的培养是生物技术的关键因素。在研究阶段，细胞培养的量少，但当研究转向有利于人类和动物健康的目的时，培养的量通常会增加。这种数量的增加通常被称为放大。某些用于研究阶段细胞培养的装置和方法已经发展成熟，这是因为它们允许培养多种不同的细胞，因此对于大多数使用者是有用的。这些装置包括多孔组织培养板、组织培养瓶、滚瓶和细胞培养袋。令人遗憾的是，这些装置效率低，并且在放大过程中它们在劳力、污染风险以及费用方面的效率就变得更低了。这就需要开发替代的装置和方法，这类装置和方法用于研究并保持改进的放大研究和放大效率。这个讨论确定了常规技术中的许多缺陷，并且提出解决方法，所述方法随后将进行更详细的描述。对于研究规模的细胞培养来说一个必要的属性是低复杂性。复杂性降到最低的装置不需要辅助设备来混合或灌注用于细胞培养的培养基。它们通常是指静置装置。静置装置可以再分为两大类:1)非透气性且通过气/液界面给细胞提供氧气的装置和2)透气性且通过穿过装置的室以气体交换的方式给细胞提供氧气的装置。传统的陪替氏培养皿、多孔组织培养板、组织培养瓶和多架组织培养瓶属于第一类。细胞培养袋和室化瓶(compartmentalized flask)属于第二类。由于包括静置装置中培养基驻留高度受限在内的各种原因，所有这些静置装置的效率都很低。由于提供气体交换的方法方面的原因,培养基在陪替氏培养皿、多孔组织培养板、组织培养瓶和多架组织培养瓶中的高度受限。为了满足细胞的需要，氧气必须从气/液界面扩散到装置中驻留有细胞的下表面。为了确保充足的氧气供应，推荐在这些装置中所采用的用于细胞培养的培养基的最高高度为约3mm。培养基的高度受限会导致各种缺陷。这会形成很小的只能支持少量细胞的培养基体积。培养基需要连续地取出和添加以维持培养，由此增加了操作的频度、劳力和污染风险。在装置中培养更多细胞的唯一方式是使装置的占地面积更大，从而可以存在更多的培养基。制造占地面积大的装置从制造观点来看是个挑战，很快超过了在典型培养箱和无菌工作台中可用的空间，使装置更加难以操作。因此，可商购获得的细胞培养装置是小的。因此，放大培养需要多个装置或选择更精密、复杂而昂贵的替代方式。依靠气/液界面来发挥作用的静置装置存在一些固有的问题，组织培养瓶就是一个很好实例。组织培养瓶中允许细胞驻留表面的面积范围典型地为25cm2至225cm2。推荐用于组织培养瓶的培养基高度在2_和3_之间。例如,Coming 推荐它的T-225cm2瓶工作体积为45ml 67.5ml。因此，IOOOml的培养物需要15 22个T_225cm2瓶。这样不仅需要给15 22个装置装料，从而导致劳力和污染风险增加，而且由于培养瓶以容纳约95%气体和仅5%的培养基的方式进行设计，因此空间的利用效率非常之低。例如，典型的T-175瓶的占地面积约为23cm长Xllcm宽，高约3.7cm，因此占约936cm3的空间。然而操作时所述培养瓶典型地具有不超过约50ml的培养基。因此，在瓶体(50ml)中存在的培养基相对于瓶体(936cm3)所占的空间显示出培养瓶容量几乎95%只不过是气体。空间的低效利用除了浪费宝贵的培养箱空间外，还增加了运输、灭菌、储存和处置的费用。常用于研究规模的细胞培养的装置的另一个例子是多孔组织培养板。对于传统的组织培养瓶，将气/液界面保持在每一个孔的底部上仅2mm至3mm的高度是标准的操作方法。当在细胞培养实验室中移动板时，为了防止溅出，典型的可商购获得的96孔组织培养板的每个孔约9mm深。对于6孔组织培养板，深度增加至约18mm。在96孔板的情况中，气体约占每个孔的75%，而培养基约占每个孔的25%。在6孔板的情况中，气体约占每个孔的95%，而培养基约占每个孔的5%。这种低效的几何形状增加了装置运输、灭菌、储存和处置的费用。在许多应用中，需要通过取出或替换少量的培养基来经常供给培养物是会有问题的。例如，如果多孔组织培养板的目的是为了进`行试验，则操作培养基可能会影响到那些试验的结果。而且，由于培养基的量如此之少，只要少量蒸发就可能会发生溶质浓度的不利变化。允许培养基以较高的高度驻留而不损害细胞培养功能的多孔组织培养板，由于使需要保持培养物存活的操作最小化并且减少因蒸发引起的浓度变化的量，因此优于那些传统的培养板。频繁地更换培养基不仅耗时、昂贵，并且导致污染风险的增加。通过特定的液体操作设备如多道移液枪来缓解所述问题的尝试并没有针对问题的来源，即低培养基高度。最好的解决方法是允许在每一个孔中驻留更多的培养基。遗憾地是，这种方法对于传统培养板是不可能的，这是因为传统培养板需要通过气/液界面的方式进行气体交换。需要有更好的替代传统装置的方式。如果有这样的组织培养装置:不仅仅依靠气/液界面来发挥作用，与使用传统培养瓶和多孔板一样容易，允许在具有同样的占地面积的装置中培养更多的细胞，并且容易地和线性地放大，这些有效的改善将使使用细胞来促进人类和动物健康所需费用的降低。本文将显示如何使用透气性材料和新的构造来达到这个目的。已有不采用气/液界面作为气体交换唯一来源的细胞培养装置的提议，并且已经使所述细胞培养装置进入市场。这种方式依赖于使用下部的透气性膜来将气体交换带到培养基的底部。与仅仅依赖于气/液界面的装置相反的是，这种细胞培养装置允许更多的气体交换。所述提议和可商购获得的装置包括细胞培养袋、室化的透气瓶、透气筒、透气性陪替氏培养皿、透气性多孔板和透气性滚瓶。令人遗憾的是，所述的每一种透气装置都存在其所固有的低效率和放大缺陷。细胞培养袋、透气筒、透气性陪替氏培养皿、透气性多孔板、室化的透气瓶和透气滚瓶的主要缺陷包括培养基高度受限、透气表面的面积与培养基体积的比例过大、和对用于培养贴壁细胞的几何形状欠佳。结果使得为放大而必需采用大量的装置、限制了装置设计的选择方案以及随着放大的发生而增加费用和复杂性。对围绕着透气装置的现有技术所进行的仔细调查证明了传统观念和装置设计是如何限制培养基高度和驻留于装置中的培养基的体积的。1976年，在题目为Diffusion inTissue Cultures on Gas-permeable and Impermeable Supports(Jensen 等，J.Theor.Biol.56,443-458(1976))的文章中，分析了由透气膜制成的封闭容器的操作理论。Jensen等将扩散描述为培养基中溶质运输的方式，并且该文章提到“扩散按照菲克定律(Fick’ slaws)进行”。Jensen等提到“图2[Jensen等的]显示在由透气性材料制成的袋中培养的细胞的扩散特点”。本文中的

图1A显示Jensen等的图2，其中Dcm是培养基的扩散常数。本文的图1B显示Jensen等的图3，其中将透气容器中的PO2和PCO2的稳定态值的模型显示为基于扩散的整个培养基的线性衰减。在1977 年，Jensen (Jensen, Mona D.“Mass cell culture in a controlledenvironment，，,Cell Culture and its Applications,Academic Pressl977)描述了一种通过使用“透气无孔的塑料膜”来形成细胞培养装置的“主要创新”。本文的图2显示Jensen的图2。如图2所示，该装置形成了非常低的仅0.76mm的培养基高度和非常高的透气表面的面积与培养基体 积的比例。为了放大，该装置长达30英尺，并且使用常规的设备进行灌注。在1981 年，Jensen (Biotechnology and Bioengineering,第 XXIII 卷，第2703-2716页(1981))特别提到“培养容器设计必须体现出对于培养的所有细胞来说是固定和恒定的小的扩散距离。该设计必须使得放大培养不改变扩散距离”。事实上，培养基不应当驻留于远离透气性膜的高度上的传统的观念一直延续到今天，如通过利用透气性材料的商业产品和与它们有关的专利就是明证。而且，透气表面的面积与培养基体积的高比例也还继续采用。从1981年起，各种透气的细胞培养装置已经进入市场，并受到了人们的推崇。然而，根据对用于透气装置的发明、装置设计、装置说明和操作说明书的观察，继续依赖于将扩散作为主要设计因素的扩散似乎是理所当然的。作为设计标准，用于扩散的模型限制了培养基的高度，造成透气表面的面积与培养基体积的高比例，并且提供低效的装置几何形状。可商购获得的透气的细胞培养袋形装置是目前用于细胞培养的标准装置形式。如同Jensen的构造，这些产品允许通过透气性材料穿过培养基的上下表面进行气体交换。与Jensen提出的装置不同的是不需要进行灌注。典型地，它们不进行灌注，而是置于细胞培养的培养箱中。这降低了费用和复杂性，并且使它们成为市场上可接受的装置。然而，当其中驻留细胞培养基时，在透气性膜之间的有限距离对于使它们具有不适合用于有效地放大的几何形状。由于需要更多的培养基，袋子的尺寸在横向方向上必须按比例加大。于是，尺寸超过2升对它们来说由于会使放大需要大量的装置，因此通常是不可行的。而且，它们与用于传统装置的标准的液体处理用具不匹配，从而增加了进行研究规模的培养的复杂性。袋子是通过将两片透气膜层压在一起而制成的。一个典型的袋子的剖面图显示在取自于美国专利N0.5686304的图3中，这种袋子已经被商化为S1-Culture 袋(MedtronicInc.)。传统静置细胞培养装置的一个有利特征是培养基均匀地分布于驻留细胞的区域中。为确保培养基在整个装置中的高度恒定的目的，本领域技术人员特别需要注意调整培养箱水平。通过观察图3中袋子的剖面图，可以看出为什么不管培养箱的水平如何，培养基在整个下部的透气性膜上并没有处于一致的高度。因为膜在周边进行接合，所以培养基被强制驻留于靠近周边而不是袋子中别的地方的不同高度。随着培养基体积的增加，袋子开始呈现出圆柱形，因此培养基分布变得更差。由于形状不一致，细胞遭遇到潜在的营养梯度。如果袋子中的培养基过多，则下表面将呈非水平状态。那样也会产生问题。驻留于袋子中的悬浮细胞将分布不均。相反，它们将由于重力作用而沉积在低点、堆积并因营养和氧气在积堆内形成梯度而死亡。在贴壁细胞的情况中，它们接种也是不均匀的，这是因为驻留于袋子每一部分的接种物的量发生变化。如果袋子过满，除了产生几何形状问题之外，培养基的重量超过IOOOml也可能使如美国专利N0.5686304描述的袋子损坏。即使克服袋子的几何形状缺陷，基于当培养基驻留的高度过高时扩散障碍将阻止装置发挥作用的观念，与袋子和透气的其它装置有关的说明和专利表明仍然存在缺陷。细胞培养袋是从OriGen Biomedical Group (OriGen PermaLife 袋)、Baxter (与美国专利 N0.4829002、4937194、5935847、6297046B1 相关的UfecelK X-Fold )、Medtronic (S1-Culture ,美国专利 N0.5686304)、Biovectra (VectraCell ) > 和美国Fluoroseal (VueLife 培养袋系统，被美国专利N0.4847462和4945203所包含)商购的。说明书、操作说明书和/或专利规定了各产品的培养基的高度和透气表面的面积与培养基体积的比例。Pattillo 等(转让给 Baxter International Inc.的美国专利 N0.4829002 和4937194)指出，一般将袋子“填充到约占总容积的四分之一至二分之一，以提供相对高的培养基的体积的内表面积与细胞的比例，使得大量的氧气可以扩散到袋子内，并且二氧化碳可以扩散到袋子外，从而有利于细胞的代谢和生长”。根据Pattillo等的描述，对于Baxter Lifecell X-FoldTM袋子来说，可以获得最佳培养基高度的是它们的600cm2袋子，该袋子获得1.0cm至2.0cm的培养基高度，并且透气表面的面积与培养基体积的比例为
2.0cm2/ml 至 1.0cm2/ml。VectraCell 袋子的产品说明提到“VectraCelllL的容器可以容纳至多达500mL的培养基。VectraCell3L的容器可以容纳至多达1500mL的培养基”。因此，如同Baxter袋子那样，最大培养基体积是袋子总容量的一半。在所提供的各种尺寸的袋子中，3L的袋子所允许的培养基高度最高，为1.92cm，并且最小的透气表面的面积与培养基体积之比为1.04cm2/ml。对于在产品说明和美国专利5686304中载明的S1-Culture 袋，当驻留于进行物理混合培养基的定轨摇 床中时，推荐的培养基高度的1.6cm。当在混合环境中使用时,如此可获得透气表面的面积与培养基体积的比例为1.25cm2/mL.由于混合通常用于破坏扩散梯度并且加强溶质的转移，本领域的技术人员应该明了，当袋子不放在定轨摇床中时，培养基的高度应会降低。
在VueLife 袋子的产品说明中特别推荐用高度不超过I厘米厚的培养基填充VueLife 培养袋，这是因为“额外的培养基可能会影响营养或气体的扩散”。因此，有关扩散的因素限制了 VueLife 袋中的培养基高度。如此在1.0cm的培养基高度获得了透气表面的面积与培养基体积之比为2.0cm2/mloOriGen PermaLife 袋的产品说明载明了在1.0cm的培养基高度(与VueLife 的高度相同)的额定容量。在所提供的各种PermaLife 袋中，它们的120ml的袋子所提供的最小透气表面的面积与培养基体积的比例为1.8cm2/mL.
有限的培养基高度的最终结果是采用这些产品进行放大是不实用的。例如，如果放大Lifecell X-Fold 袋，以使其在2.0cm的培养基高度能够容纳IOL的培养基，其所需的占地面积将至少为5000cm2。这不仅是难以处理的形状，使占地面积会很快超过标准的用于细胞培养的培养箱，导致需要定做的培养箱。而且，在袋子中所利用的气体交换面积比所需的面积更大，这是因为所有这些构造都依赖袋子的上下表面来进行气体交换。

这种不实用的几何形状已经限制了可商购获得的袋子的尺寸。从各供应商获得的最大袋子在振荡时所推荐的培养基体积为:0riGen PermaLife 袋的220ml、VueLife 袋的730ml, LiibccliK X-Fold 袋的 1000ml、VectraCell 袋的 1500ml 以及 S1-Culture 袋的2000ml。因此，放大需要用到大量的单个袋子，使该过程的效率由于包括劳力和污染风险加大等各种原因而降低。细胞培养袋的另一个缺点是它们不象常规培养瓶那样容易使用。液体进出都很麻烦。它们设有与注射器、针或泵管适配的管连接。这适合于封闭系统操作，但是对于研究规模的培养，使用移液枪是处理液体更容易和更常用的方法。当需要加到或取自袋子的培养基的量超过典型的大型注射器的60ml体积时，不能使用移液枪是非常不方便的。在该种情况下，每转移60ml，注射器必须与导管连接又脱接。例如，包含600ml的袋子将需要与60ml注射器进行高达10次的连接和10次的脱接，增加了处理袋子的时间和污染的可能性。为了使连接的次量减到最小，可以使用泵来转移培养基。然而，这增加了小规模培养的费用和复杂性。许多利用细胞培养袋的杂交瘤核心实验室一经开始就填充它们，并且不再加入细胞，这是由于这些连接和泵的复杂性所引起的高污染风险性。Matusmiya等(美国专利N0.5225346)试图通过对袋子和培养基储存室进行整合来解决液体输送的问题。将培养室和培养基储存室连接起来，当需要新鲜的培养基时，将培养基从培养基室输送到培养室。虽然这能够有助于培养基的输送，但是没有解决限制袋子放大效率的培养基高度有限和透气表面的面积与培养基体积的比例高的问题。该发明所提供的培养基高度为0.37cm，透气表面的面积与培养基体积的比例为5.4cm2/mL.
筒式透气的细胞培养装置已被引入市场，与细胞培养袋不同的是，该装置具有侧壁。这些类型的装置利用侧壁来将透气的上下膜分开。这允许整个装置的培养基高度一致。遗憾的是，由于这些装置只含有少量的培养基，因此甚至比袋子更不适合放大，因为它们仅包含少量的培养基。培养基体积小是试图产生高的透气表面的面积与培养基体积的比例的结果。有一种由BioChrystal公司提供的产品称为OpticcH:这种产品是一种容器，它通过透气性硅树脂膜而固定在各具有50cm2表面积的上下表面上。侧壁所包括的材料不是选择用于气体交换，而是提供分离上下气体膜所需要的刚性。产品说明强调了它的关键特征，“两个生长表面具有大的表面积与体积的比例”。在Genetic Engineering News的有关这种产品的一篇文章(2000年12月第20卷第21期)中，专利申请人Barbera-Guillem提到“采用微滴板的占地面积，使膜面积已经得到最大化，而体积得到最小化，从而获得提供具有最大气体交换的大的生长面积”。这种确定如何使用这种产品的操作程序规定了只导入IOml培养基，据此限定培养基可以驻留的高度为0.2cm。涉及这种装置的美国专利申请N0.10/183132 (2002年6月25日申请)提到高度达到0.5英寸(1.27cm)是可能的，但是更优选的高度是约0.07英寸至约0.08英寸(0.18cm至约0.2cm)。也与这种装置有关的W00056870提到高度高达20mm是可能的，但是更优选的高度为4mm。即使在商业装置中采用如该专利中描述的更高的高度，即1.27mm，所述培养基高度也不会超过袋子允许的高度。此外，如此只会将透气表面的面积与培养基体积的比例降低到1.0OcmVml，这与所述袋子是相似的。美国专利申请N0.10/183132显示一种结构，其中装置只有一个侧面是透气的。在未经商业化的所述结构中，在0.5英寸(1.27cm)的培养基高度获得的透气表面的面积与培养基体积的比例为0.79cm2/ml，该比例比细胞培养袋的要低一些。因此，尽管有侧壁，甚至当几何形状允许培养基达到最大高度时，相对于袋子，这种结构也没有改善放大效率。筒式透气的细胞培养装置也已经由Laboratories MABIO-1nternationaf 引入市场,该装置称为CLINIcell Culture Cassettes。与OpticeU —样,该装置的产品设计与操作说明均没有提及相对于袋子来说增加了的培养基高度、或降低了的透气表面的面积与培养基体积的比例。CLlNkdbt 25Culture Cassettes的操作说明提到,驻留于25cm2的下部的透气性表面上的培养基不应当超过10ml。由于下部的透气性材料的表面积仅为25cm2，因此形成的培养基高度只有0.4cm。而且，由于装置的顶部和低部均由透气性材料构成，因此透气表面的面积与培养基体积的比例高，为5.0cmVmlo CLINIcell 250Culture Cassettes的操作说明提到，驻留于下部250cm2透气性表面上的培养基不应当超过160ml，因此形成的培养基高度低，为0.64cm,并且透气表面的面积与培养基体积的比例高，为3.125cm2/mL.
筒式透气的细胞培养装置最近也已经由Celartis引入市场,称为Petaka 。与Opticell 和CLINIcell Culture Cassettes 一样，这些装置也具有侧壁，该侧壁具有作为分离上下透气性膜的单元的作用。与那些产品不同`的是，该装置与标准的移液枪和注射器是相容的，因此液体处理更加方便。然而，该装置的产品设计与操作说明均没有提及相对于袋子来说增加了的培养基高度、或降低了的透气表面的面积与培养基体积的比例。操作说明提到，驻留于透气上下表面之间的培养基不应当超过25ml，所述上下表面的总表面积为160cm2。产品说明载明“最优化的培养基/表面积”为0.156ml/cm2。因此，培养基高度仅为
0.31cm,而最优化的透气表面的面积与培养基体积的比例为6.4cm2/mL.
当回顾这些装置可获得的最大培养体积时，可商购获得的用于放大的筒式透气的细胞培养装置的缺陷就会变得清楚。Opticell 提供的培养体积至多达10ml，CLINIcell Culture Cassettes提供的培养体积至多达160ml,而Petaka 提供的培养体积至多达25ml ο因此，仅为进行IOOOrnl的培养，就需要100个Opticeli 筒，7个CLINIcell CultureCassettes,或 40 个 Petaka 筒。Vivascience Sartorius Group将称为petriPERM的透气性陪替氏培养皿引进市场。petriPERM35和petriPERM50分别采用常规的35mm和50mm直径的陪替氏培养皿产品的形式。底部是透气性的。PetriPERM35mm培养皿和petriPERM50mm培养皿的高分别为6mm和12mm。Vivascience产品说明显不petriPERM35的透气性膜的面积为9.6cm2,最大的液体体积为3.5ml，得到的最大培养基高度为0.36cm。而petriPERM50的透气性膜面积为19.6cm2，最大液体体积为10ml，得到的最大培养基高度为0.Slcn^petriPERM产品设计成具有盖子，其允许培养基的上表面与周围的气体交换，下部的透气性材料允许培养基的下表面与周围的气体交换。因此，petriPERM35的透气表面的面积与培养基体积的比例的最小值为1.74cm2/ml, petriPERM50的最小值为1.96cm2/ml。与其它的透气装置一样，petriPERM产品用于放大的效率也很低。仅为了进行IOOOml的培养，就需要至少100个装置。而且这些装置不能作为封闭系统进行操作。Gabridge (美国专利N0.4435508)描述了设有与陪替氏培养皿一样的顶盖的透气的细胞培养装置，其设计用于高分辨的显微镜。孔的深度是基于“显微镜的最方便的尺寸”，即0.25英寸(0.635cm)。该装置最大能够容纳0.635cm厚度的培养基。Vivascience Sartorius Group 也已经将称为 Lumox Multiwell 的透气多孔组织培养板引进市场。这些产品也由Greuner Bio-One分销。它们采用24孔、96孔和394孔形式。板的底部是由具有非常低的自动荧光的透气的50微米膜制成。就每个孔的壁高来说，24孔类型的为16.5mm, 96孔类型的为10.9mm, 384孔类型的为11.5mm。就每个孔的培养基的规定最大工作高度来说，24孔类型的为1.03cm，96孔类型的为0.97cm，384孔类型的为0.91cm。尽管相对于常规的多孔板培养基高度有所改善，但是它仍然落在其它静置透气装置的限制界限之内。Fuller等(W001/92462A1)提出了一种透气多孔板，该板通过构造表面，增加了底部透气性硅树脂材料的表面积。然而，壁高被限制为只有“标准微滴板”的高度，因此，相对于传统板并没有增加培养基高度。通常，如果静置透气的细胞培养装置可以利用比可商购获得的装置所使用的膜更厚的膜，这将是有利的。如美国专利N0.5686304所述，按照依赖于硅树脂的单室静置透气的细胞培养装置的常规观念规定，适当的功能需要厚度等于或小于约0.005英寸的透气性材料。S1-Culture 袋由二甲基娃树脂构成，厚约0.0045英寸。Barbera-Guillem等(美国专利申请N0.10/183132)和Barbera-GuiIlem(W000/56870)提到，当膜由下列合适的聚合物构成时，透气性膜的厚度可以在约小于0.00125英寸至约0.005英寸范围内，所述的聚合物包括聚本乙纟布、聚乙纟布、聚碳Ife酷、聚纟布经、乙纟布乙Ife乙纟布酷、聚丙纟布、聚讽、聚四氣乙火布或硅氧烷共聚物。保持这样薄的膜是不利的，这是因为这种膜易于穿孔，在制备中容易形成针孔，并且除了压延之外，很难通过其它的方法制造，所述的压延法除了片状外形之外，不允许其它外形。本文将说明如何超出传统观念而增加硅树脂厚度而不会妨碍细胞培养。改进的静置透气装置是需要的。如果透气装置能在竖直方向上放大，效率将会提高，这是因为大量的培养能够在任何给定占地面积的装置中进行，并且可以得到更多的人机工程学的设计方案。室化的静置透气装置是提供了传统培养装置的替代方式的另外一种类型产品。然而，它们的放大效率也为培养基高度受限和过高的透气表面的面积与培养基体量的比例所限制。这些类型的装置对通过将细胞截留在透气性膜和半透膜之间来形成高密度的培养环境是特别有用的。尽管未经商业化，但是Vogler (美国专利N0.4748124)公开了室化的装置结构，该结构将细胞置于靠近透气性材料，并含有非透气性的侧壁。这种细胞隔室由下部的透气性材料构成，并且通过上部的半透膜限定。培养基室直接并且完全地驻留于半透膜上。透气膜驻留于培养基室的顶部。培养基经限制而完全驻留于装置的透气底部。该专利描述了这样的试验，该试验采用由0.4cm侧壁构成的细胞培养室、由0.8cm侧壁构成的培养基室、9ml的细胞培养体积、18ml的基础培养基体积、22cm2的透气下膜和22cm2的透气上膜。这形成了 0.4cm的细胞室培养基高度，并允许培养基驻留于培养基室中的高度为0.8cm。此外，总透气表面的面积与总培养基体积之比高，为1.76cm2/ml。在一篇题为“ACompartmentalized Device for the Culture of Animal Cells” (Biomat., Art.Cells,Art.0rg.，17 (5) ,597-610 (1989))的文章中，Vogler 提出使用美国专利 N0.4748124 装置的生物结果。该文章特别引用1976年Jenson等和1981年Jenson的文章作为“操作的理论基础”。测试设备的尺寸描述如下:下部的透气性膜为28.7cm2、上部的透气性膜为28.7cm、高度为0.18cm的细胞室壁允许5.1ml的培养基驻留于细胞室中，0.97cm高度的培养基室壁允许27.8ml的培养基驻留于培养基室中。细胞室中培养基的总高度被限制至0.18cm，培养基室中的总高度被限制至0.97cm，透气总表面积与培养基总体积的比例高，为1.74cm2/mL.
Integra Biosciences销售有称为CELLine 室化的透气产品。如同Vogler的装置一样，细胞室有下部的透气性膜与上部的半透膜限定。然而，与Vogler的几何形状不同的是，装置中所有的培养基不需要全部驻留 于透气性膜上。仅需要基础培养基的一部分驻留于半透膜上。该专利包括了 Integra Biosciences产品,该专利与产品说明描述了在细胞室中将液体高度保持低于约15mm的必要性。并描述每平方厘米透气性膜的表面积5ml至IOml的营养培养基的比例对于细胞维持是适当的(美国专利N0.5693537和美国专利N0.5707869)。尽管就加料频率最小化来说，增加培养基体积与细胞培养面积的比例是有利的，但是实践中每平方厘米透气表面的面积上的培养基高度是有限的。这些专利包括的装置的商业设计表明，它们与其它透气装置一样，限制了可以驻留于细胞上的培养基的量。为了降低直接驻留于细胞上的培养基的高度，培养基体积有一半并没有直接驻留于半透膜上面的区域中。装置的非透气性侧壁经设计使得当根据使用说明操作装置时，CELLine 产品中半透膜上所驻留的培养基的高度在CLlOOO中为约3.8cm，在CL350中为2.6cm,在CL6Well中为1.9cm。当根据使用说明操作时，细胞培养室中所驻留的培养基的高度在CLlOOO中为15mm，在CL350中为14mm，在CL6Well中为26mm。该专利描述和该装置采用了在培养基上表面上的气/液界面。因此，由于穿过装置的底部以及在培养基的顶部进行气体交换，因而也限制了气体交换表面积与培养基体积的比例。就每一装置的气体交换表面积与培养基体积的比例来说，CLlOOO的约为0.31cm2/ml,CL350的约为0.32cm2/ml, CL6ffell的约为 1.20cm2/ml。Bader(美国专利N0.6468792)也介绍了室化的透气装置。该装置没有侧壁，而是采用袋子形式。利用多孔膜进行室化而将细胞与营养物分离。如同其它的室化的透气装置一样，培养基高度也受到了限制。美国专利N0.6468792尽管提到在设备中可以得到Icm至2cm的培养基高度，但是实际高度需要按“根据菲克扩散定律(Fick’s law of diffusion)的培养基层”的功能根据O2供应来调节。由于袋子的上下表面具有透气性，因此当该设备被填充到最大容量时，可获得的透气表面的面积的总量与培养基体积的总量的最小比例为
1.0cm2/ml。如果室化的透气装置能够提高在竖直方向的放大潜力，随着培养量的增加，它们将具有更有效的占地面积。能够适合于竖向放大的静置室化的透气装置是需要的。已经推出了相对于静置透气装置来说旨在提高效率的透气装置。该装置以与传统滚瓶相似的方式操作，并且试图通过采用滚动作用混合培养基来改进物质的交换。然而没有取得有效的放大。一个原因是，与静置装置一样，设计规格限制了可以驻留的培养基与透气装置的壁的距离。这限制了装置的培养基容积。因此，放大需要多个装置。Spaulding(美国专利N0.5330908)公开了具有环形的透气壁结构的滚瓶。内圆筒壁和外圆筒壁与周围气体进行交换。壁具有透气性质，可为细胞提供氧，所述细胞驻留于由内圆筒壁和外圆筒壁限定的室中。该细胞室被培养基完全填充，就限制细胞剪切来说，这是有利的。Spaulding提到“氧气效率的下降是培养基中输送距离的函数，并且有效性被限制到距离氧气表面约I英寸或I英寸以下”。因此，Spaulding提到的设计的缺陷包括为提供充足的氧气，内圆筒壁和外圆筒壁之间的距离保持在等于或小于5.0lcm0以此方式，细胞不能驻留于距离透气壁超过2.505cm处。那样还导致透气表面的面积与培养基体积的比例为约0.79cm2/mL.此外，由于需要具有中空的透气中心部分，因此浪费了空间。该装置每5cm长度仅具有IOOml培养基的内部体积,相反,相同长度的传统培养瓶具有500ml。培养基体积的受限使这种装置与传统滚瓶相比，其放大的效率更低，这是因为相等体积的培养需要更多的瓶子。该装置的另一个问题是使用了蚀刻孔，孔的直径为90微米，用于气体交换。这些孔足够大到可以允许气体进入，但是足够小到可以阻止液体从细胞室中排出。然而，由于大多数无菌过滤器阻止0.45微米的颗粒，更普遍的是阻止0.2微米的颗粒穿过，因此它们能够允许细菌透过细胞室。在1992年12月申请的一件专利中，Wolf等(美国专利N0.5153131)描述了一种透气的生物反应器，其具有沿着它的轴滚动的盘状结构。这种装置的几何形状试图纠正Schwartz等在美国专利N0.5026650所提出的缺陷。在美国专利N0.5026650中，透气的管状插入物驻留于圆筒状滚瓶内，并且外部的壳体不具有透气性。尽管它对附着在珠子上的贴壁细胞的培养是成功的，但是Wolf等提到该装置在悬浮细胞培养中并不成功。该装置设有一个或两个透气的平末端。为了降低离心力的影响，所述盘的直径被限制至约6英寸。该发明人提到“培养基中氧 气的分压或分压梯度的降低是渗透性膜的距离的函数”，这与Jensen在1976年表达的思想方法相同。他们还提到“如果距离渗透性膜太远，细胞将不会生长”。因此，当盘的两端具有透气性时，宽度被限制至小于2英寸。这种尺寸限制意味着该装置可以容纳的大多数培养基小于1502ml。因此，随着培养规模的放大，必须使用越来越多的装置。而且，透气表面的面积与培养基体积的比例必须至少为0.79cm2/cm,并且细胞必须驻留于与透气的壁的距离小于1.27cm处。此外，该装置不适合用于现有的实验室设备，并且需要特定的旋转装备和气泵。在1996年2月提交的一件专利中，Schwarz (美国专利N0.5702941)描述了具有以与滚瓶相似的方式滚动的透气末端的透气盘状生物反应器。令人遗憾的是，和美国专利N0.5153131 一样，所述生物反应器的长度被限制至等于或小于2.54cm。除非生物反应器的所有的表面都具有透气性，否则距离甚至变得更小。最大的装置的直径为15.24cm。因此，透气表面的面积与培养基体积的比例必须至少为0.79ml/cm2,并且细胞绝不会驻留于与透气的壁的距离大于1.27cm处。即使具有滚动作用，但是相对于传统静置培养袋，这也不会使透气表面的面积与培养基体积的比例发生实质性的下降，并且随着培养规模的放大，将需要越来越多的装置。来自Synthecon Incorporated 的可商购获得的称为 Rotary Cell CultureSystem 的产品系列,该产品结合了 Spaulding、Schwarz和Wolf等的专利的各个方面。所得产品的培养基容积小，为IOml至500ml，该产品需要通常的滚动装备，与标准实验室移液枪不相容，并且与能容纳相同体积的培养基的传统装置的费用相比，费用非常昂贵。因此它们由于没有满足在单个装置形式提高效率的需要，在市场上几乎没有什么影响。Falkenberg等(美国专利N0.5449617和美国专利N0.5576211)描述了采用透析膜室化的透气滚瓶。该瓶可以容纳的培养基的体积为360ml，其中60ml驻留于细胞室中，而300ml驻留于营养室中。在一个实施方式中，瓶的端部均具有渗透性。美国专利N0.5576211提到，当瓶的端部具有透气性时，“具有至少50cm2的表面积的气体交换膜已证明适用于35ml的细胞培养”。因此，透气表面的面积与体积的最小比例为1.43cm2/ml。在另一个实施方式中，瓶体具有透气性，其表面积为240cm2。该透气表面可为驻留于该容器中的全部360ml体积的培养基提供氧气。因此，透气表面的面积与体积的的最小比例为0.67cm2/mL.瓶子的直径约5cm，瓶子的长度约15cm。因此，瓶子比传统滚瓶要小得多，传统滚瓶的直径约11.5cm，长度至多达约33cm。尽管这种装置可用于高密度悬浮细胞培养，但其受限的培养基容量不能减少放大所需要的装置的数量。因此，该装置由于不能提供附着的表面积，因此不适合于贴壁培养。Falkenberg等(美国专利N0.5686301)描述了在美国专利N0.5449617和美国专利N0.5576211所详细说明的装置的改进类型。该专利公开了形式为防止内部压力造成损害的活动外壳(collapsible sheathing)的特征。气体由瓶子端部提供,并且可以通过透气外壳“扩散进供应室”中。令人遗憾的是，由于瓶子的尺寸没有变，因此不能降低放大所需装置的数量。而且所改进的类型仍然不适合于贴壁培养。

Vivascience Sartorius Group 销售了一种称为 miniPERM 的产品，该产品与Falkenberg等的专利有关。细胞室的最大单元为50ml，最大营养单元为400ml。因此，可以驻留于该商业装置中的培养基的最大体积为450ml。商业装置的尺寸小，并且需要常规滚动设备，使其成为无效的解决放大问题的方案。存在改进滚动的透气装置，以便使它们能为每个装置提供更多的培养基，由此减少了放大所需装置的数量的需要。如果存在降低的透气表面的面积与培养基体积的比例，则可以达到上述效果。另一个问题是需要非标准的实验室设备来对现有装置进行操作。标准实验室设备的使用还会允许更多的使用者使用这种技术。先前的讨论集中在限制现有和所建议的细胞培养装置中的放大效率的设计缺陷上。除了前面描述的限制外，当目的是进行贴壁细胞培养时，另外还有限制放大效率的问题。对于依赖于气/液界面来提供氧气的传统的静置装置来说，贴壁细胞培养效率低是由每个装置的附着表面积受限所造成的。例如，对于陪替氏培养皿、多孔板和组织培养瓶来说，只有装置的底部适合用于细胞附着。传统培养瓶提供了这个问题的一个很好的实例。如前面描述的那样，典型T-175瓶约占936cm3。然而，它只提供175cm2用于贴壁细胞附着的表面积。因此，占据空间与生长表面的比例为5.35cm3/cm2，效率非常之低。试图解决传统培养瓶表面积缺陷的产品是存在的。多架组织培养瓶如NUNC CellFactory (美国专利 N0.5310676)和 Corning CellStack (美国专利 N0.6569675)通过在竖直方向堆积聚苯乙烯架来增加表面积。这种装置设计成允许培养基和气体驻留于架子之间。当培养细胞的数量增加时，相对于传统培养瓶，这降低了装置的占地面积。多架培养瓶的外形也比传统培养瓶具有更高的空间效率。例如，NUNC Cell Factory的隔板之间的空间约1.4cm，相反，典型T-175培养瓶底部和顶部之间的距离为3.7cm。就灭菌、运输、储存、培养箱空间和装置处置来说，空间使用减少节省了资金。这种类型的装置也降低了在放大时的处理量，这是因为不同于对多个组织培养培养瓶进行加料，这种类型的装置允许对一个多架装置进行加料。此外，传统的聚苯乙烯的使用是很容易解决的。遗憾的是，该装置在效率方面并不是最理想的，因为它的每一个架子都需要气/液界面来提供氧气。CeUCube 是一种可由Corning Life Sciences获得的贴壁细胞培养装置。它采用与多架组织培养瓶相似的方式构造，但是它淘汰了气/液界面。由于不存在气体，在竖向堆积的细胞附着架子之间的距离减小了。这减少了装置所占的空间的量。然而，为了提供气体交换，需要连续灌注经氧气处理的培养基。相对于Corning CellStack 来说,这样会造成极高水平的花费和复杂性，使该装置不适用于研究规模的培养。静置透气装置没有提供比NUNC Cell Factory、Corning CellStack 或CellCube 更好的替代品。细胞培养袋和透气筒可以提供比传统组织培养瓶更大的附着面积。这是因为它们能够允许在装置的上下表面上培养细胞。然而，适于细胞附着的透气性材料比传统的聚苯乙烯要贵得多。而且，即使透气装置的上下两个表面均允许细胞生长，但是相对于占据同样占地面积的传统 的气/液界面类型的装置来说，表面积也只是增加了两倍。此外，仍然存在已在前文描述过的放大缺陷的限制。Fuller等(国际
发明者约翰·R·威尔逊, 道格拉斯·A·佩奇, 丹·韦尔奇, 艾莉森·罗贝克 申请人:威尔森沃尔夫制造公司