专利名称：一种奶牛乳腺上皮细胞培养液的制作方法
技术领域：
本发明属于哺乳动物细胞的分离、培养和鉴定技术领域，尤其是涉及一种奶牛奶乳腺上皮细胞培养液。
背景技术：
在适合的体外培养条件下，乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，是研究乳蛋白基因表达及调控的理想细胞模型。乳腺上皮细胞的这一特性，对于乳腺生物反应器具有非常重要的价值。利用体外培养的乳腺上皮细胞来检测乳腺特异性表达载体的功能，可以快速、有效地检测出乳腺特异性表达载体的表达水平。另外，具有分泌功能的乳腺上皮细胞对于研究激素、环境因子等因素对乳腺周期性发育、细胞分化和细胞凋亡的调控等有重要作用。虽然乳腺上皮细胞的重要作用得到了广泛的关注，但是乳腺上皮细胞在体外的长期培养仍然是一个艰巨的任务。迄今为止，已建立的奶牛乳腺细胞系并不多，很多细胞系只能在体外维持10-15代，之后细胞发生衰老，失去分泌功能。体外生存时间较短严重的限制了乳腺上皮细胞的应用，因此，关于该细胞体外培养的研究受到关注。目前所采用的培养体系大致相似，主要是37°C和(p=5% C02，及饱和湿度下培养。具有重要影响的是细胞培养液，由于组成成分不同，培养效果显然不同。目前常用的培养液不能满足奶牛乳腺上皮细胞体外长期生长的需要，细胞增殖活力在连续多次传代后减弱，细胞形态容易发生变化，分泌功能下降，逐渐显示衰老迹象。胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂包含3种成分，分别为:胰岛素、转铁蛋白和硒。其中胰岛素是一种蛋白质激素，由胰岛P细胞分泌，具有促进糖原、脂肪和蛋白质合成的作用，乳腺上皮细胞能够产生和分泌胰岛素结合蛋白，通过与胰岛素结合促进细胞的增殖。转铁蛋白能促进上皮细胞的有丝分裂，还能结合铁离子，减少其毒性和促进细胞的利用。硒元素是一种理想的抗氧化剂，可以组成抗氧化酶，能保护细胞膜免受氧化损伤，保持其通透性。表皮生长因子一种多功 能的细胞生长因子，在体内、体外对多种组织细胞有强烈的促分裂增殖作用，主要针对表皮细胞。胰岛素样生长因子是氨基酸序列与胰岛素类似的蛋白质或多肽生长因子，可通过丝裂原活性蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶通路转导信号，作用于细胞的迁移、增值、分化等行为。胰岛素样生长因子-1是乳腺上皮细胞生长和分化的关键调节因子，可以诱导Gl后期和G2期的周期蛋白的表达，从而使细胞通过Gl—S细胞周期检验点，进入分裂期。还有研究表明胰岛素样生长因子-1可以与表皮生长因子联合作用，影响小鼠乳腺上皮细胞的增殖。肝细胞生长因子能刺激肝细胞DNA合成，越来越多的研究表明，该因子具有广泛的作用，可以调节多种组织细胞的增殖和分化，可以作为细胞的促有丝分裂原、形态发生素和运动因子等。有报道表明，肝细胞生长因子对小鼠乳腺上皮细胞体外增殖也具有影响。青霉素和链霉素是常用的培养液添加成分，可以抑制细菌的污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种奶牛奶乳腺上皮细胞培养液。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的:一种奶牛乳腺上皮细胞培养液，在含有φ=10 %始牛血清及φ=l %胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入如下微量成分:表皮生长因子:10_50ng/mL胰岛素样生长因子-1: 10-50ng/mL肝细胞生长因子:10-50ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。而且，所述培养基中加入的微量成分的浓度为:表皮生长因子:10ng/mL胰岛素样生长因子-I: 25ng/mL肝细胞生长因子:10ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。而且，所述培养基中加入的微量成分的浓度为:表皮生长因子:50ng/mL胰岛素样生长因子-1: 50ng/mL肝细胞生长因子:50ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。本发明的优点和积极效果是:本发明奶牛乳腺上皮细胞培养液与常规细胞培养液相比，能促进细胞长期体外生存，至少能传至20代，细胞不易老化，能够维持典型形态和分泌活性。该培养液应用于实验室可在体外获得高质量乳腺上皮细胞，为相关研究提供必要的材料支撑。
图1是实例1培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞第15代的图片；图2是实例2培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞第15代的图片；图3是实例3培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞第15代的图片；图4是不同实例培养液获得的第20代奶牛乳腺上皮细胞生长曲线图；图5是本发明培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞形成的管状结构图；图6是本发明培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞形成的索状结构图；图7是本发明培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞形成的圆顶状结构图；图8是本发明培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞形成分泌泡结构图；图9是本发明培养液中生长的奶牛乳腺上皮细胞呈CK18阳性。
具体实施例方式以下结合附图对本发明实施例做进一步详述:需要强调的是，本发明所述的实施例是说明性的，而不是限定性的，因此本发明并不限于具体实施方式
中所述的实施例，凡是由本领域技术人员根据本发明的技术方案得出的其他实施方式，同样属于本发明保护的范围。—种奶牛乳腺上皮细胞培养液，在含有(p=10%(v/v)胎牛血清及(p=l %(V/V)胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入如下微量成分:表皮生长因子:10_50ng/mL胰岛素样生长因子-1: 10-50ng/mL肝细胞生长因子: 10_50ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。实例I根据奶牛乳腺上皮细胞培养液不同组分的含量不同，对于上述奶牛乳腺上皮细胞培养液的一个优选实例为:在含有(p=10 % (v/v)胎牛血清及(p=l % (v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入的微量成分的浓度为:表皮生长因子:10ng/mL胰岛素样生长因子-1: 25ng/mL肝细胞生长因子: 10ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。实例2作为对比，通过去除本发明方法提到的一些细胞因子组分，降低成本，构成了普通培养液，也是目前常用的培养液，在含有(p=10% (v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基中加
入的微量成分的浓度为:表皮生长因子:0ng/mL胰岛素样生长因子-1: Ong/mL肝细胞生长因子: 0ng/mL青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL。实例3根据奶牛乳腺上皮细胞培养液不同组分的含量不同，对于上述奶牛乳腺上皮细胞培养液的一个优选实例为:在含有(p=10% (v/v)胎牛血清及q>=l % (v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入的微量成分的浓度为:表皮生长因子:50ng/mL胰岛素样生长因子-1: 50ng/mL肝细胞生长因子: 50ng/mL
青霉素:100IU/mL链霉素:100ug/mL奶牛乳腺上皮细胞培养液的应用(I)组织块培养。用含有双抗的PBS将乳腺组织冲洗干净，去除脂肪、血管和结缔组织，剪成0.5^1.0mm3的组织块；将组织块均匀摆置于60mm培养皿中，组织块每块间隔0.5cm左右，室温放置，待组织块贴附，培养皿中滴加500uL培养液，放置于环境条件为37°C、(p=5 % C02、饱和湿度下培养，24h后，在培养皿中补加4mL培养液，待细胞迁出长满后，消化传代细胞；(2)细胞消化。在上述培养皿中，待乳腺上皮细胞汇合成片后，对培养皿吸弃上清，PBS清洗两次，然后加入消化液(9=0.25 %的胰酶和(p=0.08%的EDTA) 2mL,消化5-1Omin，待胞质回缩，细胞间隙变大后，对培养皿中加入2mL的含有(p= 10%血清的基础培养液终止消化；(3)制备细胞悬液。对培养皿内使用吸管轻轻吹打，使细胞脱壁，将混悬液移入离心管中，收集细胞悬液，800r/min离心3 5min，弃掉上清，加入细胞培养液制成细胞悬液；(4)细胞传代。将细胞悬液接种在新的培养皿中，在环境条件为37°C、(p=5% CO2、饱和湿度下培养。(5)形态学观察，在细胞传代培养过程中，在倒置相差显微镜下，观察记录细胞形态学变化。不同培养液对奶牛乳腺上皮细胞体外生长的影响分别取来源于不同培养液培养的第20代奶牛乳腺上皮细胞。将细胞以IxiO4lIir1的密度分别接种于24孔细胞培养板中，每孔加入lmL。环境条件为37°C、q>=5 % CO2、饱和湿度下培养。每天在同一时间分别 消化收集4孔细胞，分别计数，求平均值。以培养时间为横坐标，平均每孔的细胞数为纵坐标，绘制不同培养液培养的乳腺上皮细胞的生长曲线。乳腺上皮细胞的生物学特征检测将奶牛乳腺上皮细胞以较高的密度(2 X IO5Iiir1)接种在培养皿中，经过10-14天连续培养，观察细胞形态学 变化。通过免疫荧光染色，检测Cytokeratinl8 (CK18)的表达情况。免疫荧光染色的步骤为:(I)吸弃培养液，无钙镁PBS缓冲液洗3次；(2) w=4% 多聚甲醒固定 25min ;(3)无钙镁PBS缓冲液洗3次；(4) w=l%牛血清白蛋白封闭30_60min ；(5)加入兔抗人CK18，于4°C过夜；(6 )无钙镁PBS缓冲液洗3次；(7)加入Cy3标记的山羊抗兔IgG室温孵育Ih ；(8 )无钙镁PBS缓冲液洗3次；( 9 )荧光显微镜下观察。试验结果奶牛乳腺上皮细胞体外生长及形态学观察组织块法培养的乳腺组织，接种3d后，有细胞逐渐从组织边缘迁出，主要是生长较快的成纤维细胞，上皮细胞迁出较晚。成纤维细胞和上皮细胞的界限明显，成纤维细胞呈漩涡状生长。乳腺上皮细胞呈典型的铺路石样生长，细胞间界限不清，接触紧密。经过几次传代可以得到较纯的乳腺上皮细胞。用发明培养液(实例I和实例3)培养的奶牛乳腺上皮细胞，形态典型，细胞折光性强，显示活力旺盛，如图1和图2所示。细胞生长到20代以后，仍然维持典型的形态结构。而使用常规培养液(实例2)培养的奶牛乳腺上皮细胞生长到10代以后，逐渐发生衰老，衰老的细胞体积变大、折光性差，细胞形态结构不清晰、不均一，不能形成乳腺上皮细胞特有结构，如图3所示。不同培养液对奶牛乳腺上皮细胞体外生长的影响细胞生长曲线是测定细胞生长的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。试验取不同培养液培养获得的第20代乳腺上皮细胞，以实例I和实例3培养获得的奶牛乳腺上皮细胞生长迅速，增殖旺盛，可以明显地分为潜伏期、对数生长期和平台期三个阶段。细胞接种后，第广3天生长较慢，第4天生长加快，进入对数生长期，细胞生长至第6天，基本覆盖培养孔，从第7天开始，细胞生长减缓，进入平台期。以实例2培养获得的奶牛乳腺上皮细胞，体外生长增殖缓慢，生长分期不明显，如图4所示。结果表明，以发明培养液(实例I和实例3)培养获得的20代奶牛乳腺上皮细胞均具有正常的分裂增殖能力，差异不显著，P>0.05，且两者效果均好于实例2，差异显著，P〈0.05。奶牛乳腺上皮细胞生物学特征的检测通过延长体外培养时间，以发明培养液培养的细胞可以形成奶牛乳腺上皮细胞典型形态结构，包括管状结构(如图5所示)、索状结构(如图6所示)、圆顶结构(如图7所示)和分泌泡结构(如图8所示)。用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定，结果表明，细胞表达CK18，符合乳腺上皮细胞的特 征，如图9所示。
权利要求
1.一种奶牛乳腺上皮细胞培养液，其特征在于:在含有(p=10 %胎牛血清及(p=l cvO胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入如下微量成分: 表皮生长因子:10_50ng/mL 胰岛素样生长因子-1: 10-50ng/mL 肝细胞生长因子: 10-50ng/mL 青霉素:100IU/mL 链霉素:100ug/mL。
2.根据权利要求1所述的奶牛乳腺上皮细胞培养液，其特征在于:所述培养基中加入的微量成分的浓度为: 表皮生长因子:10ng/mL 胰岛素样生长因子-1: 25ng/mL 肝细胞生长因子: 10ng/mL 青霉素:100IU/mL 链霉素:100ug/mL。
3.根据权利要求1所述的奶牛乳腺上皮细胞培养液，其特征在于:所述培养基中加入的微量成分的浓度为: 表皮生长因子:50ng/mL 胰岛素样生长因 子-1: 50ng/mL 肝细胞生长因子: 50ng/mL 青霉素:100IU/mL 链霉素:100ug/mL。
全文摘要
本发明涉及一种奶牛乳腺上皮细胞培养液，它是在含有胎牛血清及胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的DMEM/F12培养基中加入如下微量成分表皮生长因子10-50ng/mL；胰岛素样生长因子-I10-50ng/mL；肝细胞生长因子10-50ng/mL；青霉素100IU/mL；链霉素100ug/mL。本发明奶牛乳腺上皮细胞培养液与常规细胞培养液相比，能促进细胞长期体外生存，至少能传至20代，细胞不易老化，能够维持典型形态和分泌活性。该培养液应用于实验室可在体外获得高质量乳腺上皮细胞，为相关研究提供必要的材料支撑。
文档编号C12N5/071GK103103159SQ20131005254
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者李吉霞, 葛秀国, 张伟 申请人:天津农学院