专利名称：一种改造重组酶Cre的方法及其在植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域中的植物基因工程领域，涉及对重组酶Cre进行拆分，构建新的Cre/loxp系统的方法及应用。
背景技术：
在农业生产实践中，植物转基因技术应用非常广泛，该技术在改良作物品质，提高作物产量，减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量等方面做出了巨大贡献。转基因技术给我们带来巨大的经济利益和生态效益的同时，由于该技术不断发展突破并且开发利用的时间尚短，转基因植物在生态环境和食品安全等方面引起的质疑越来越多，贾士荣等认为目前人类还不能对该技术带来的潜在危险性做出正确评价，其主要原因是转基因植物当中的一些外源的选择标记基因的存在。Goldsbrough等采用转座子技术、Komari等采用共转化技术去除转基因植物中的选择标记基因，而应用最早、最广泛、最深入的是位点特异性系统中的Cre/loxp 系统。
Cre/loxp系统广泛应用于动物、植物和酵母等生物体中，尤其在小鼠当中的研究最为深入。Gilbertson等认为Cre/loxp系统是植物生物技术领域中切除转基因植物染色体上外源基因的重要工具。Sauer等早在1987年将该系统应用于酿酒酵母，首次证明了来自原核细胞的Cre重组酶在真核细胞中也会发生基因敲除。Luo等采用组织特异性启动子Bgp启动重组酶的表达，在植物体特定的器官(种子或者花粉)中达到对外源标记基因的删除。但是特异性的启动子只能控制重组酶基因在特定部位的表达，从而大大限制了 Cre/1xp系统的应用范围。蛋白-蛋白之间的相互作用对调控细胞生长等程序性的活动扮演着重要的角色，一些技术被用来检测活细胞当中蛋白-蛋白之间的相互作用。Yukichi等将萤光素酶拆分为无活性的N端和C端，分别与组蛋白H2A和H2B融合，转化拟南芥原生质体后检测到荧光素酶活性。Yang等在2003年将GUS报告基因拆分后转化拟南芥，利用内含肽介导的蛋白互补技术在转基因植物当中恢复了 GUS基因的酶活。大量研究表明，将一个完整的蛋白拆分为没有活性的两部分，通过借助一对相关的蛋白辅助因子，在两部分分别融合其中的一个辅助因子，进而达到蛋白质的重建和活性的恢复。本发明对Cre/loxp系统中的重要元件重组酶Cre进行直接拆分，将其拆分为无活性的N端和C端，将这两部分共同转化烟草发根，实现当这两部分在同一个植物细胞当中时，恢复了重组酶的活性而发生基因删除，反之将任何一部分单独转化，该系统均不具有删除活性。采用该技术对Cre/loxp系统进行改造之后，不仅可以获得没有活性的Cre/loxp系统，同时又可以根据需要使其在转基因植物当中恢复活性，增加了 Cre/loxp系统的可控性和应用范围。本发明在植物当中的应用从未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种改造重组酶Cre的方法，并将其应用于植物当中。本发明中，所述的方法是利用蛋白拆分技术将重组蛋白Cre在第59和60个氨基酸之间直接拆分为无活性的N端(NCre)和C端(CCre)两部分，对拆分蛋白进行重组活性检测。在本发明的一个具体实施方案中，将NCre和CCre构建到原核表达载体pMAL_C2X上，诱导表达纯化之后，体外检测拆分蛋白的活性。本发明中，将含有一对同向识别位点1xp的融合基因loxP-nos-loxP构建于PCAMBIA1305.1上得到中间载体pCA-LoxP，以此载体为骨架将不同的拆分蛋白构建上去，得到本发明的含有Cre/loxp系统的所有的植物表达载体。在本发明的另一个具体实施方案中，将所有的植物表达载体通过发根农杆菌介导的遗传转化转化烟草，获得烟草转基因毛状根，通过GUS组织染色和PCR分子检测改造的Cre/loxp系统的重组活性。在本发明中，体外蛋白实验证明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的时候具有完整的Cre蛋白的活性。本发明中，将拆分蛋白NCre和CCre分别构建的Cre/loxp系统转化烟草后发现当N端和C端(即NCre和CCre)在同一个植物细胞时恢复重组活性而发生删除，反之则不能。这点与体外蛋白实验结果 一致。
图1:重组酶Cre拆分为N端(NCre)和C端(CCre)的模型以及各部分融合NLS。图2:重组蛋白Cre以及拆分蛋白NCre、CCre的体外诱导表达、纯化以及活性检测结果。其中A:拆分蛋白NCre、CCre在含有麦芽糖结合蛋白标签MBP的表达载体PMAL-C2X上的表达及纯化和完整的重组蛋白Cre在pET_28a载体上的表达及纯化(其中1，2，7分别为拆分蛋白NCre的诱导，未诱导，纯化；3，4，8分别为拆分蛋白CCre的诱导，未诱导，纯化；5，6，9为麦芽糖结合蛋白标签MBP的诱导，未诱导，纯化；10，11，12分别为完整的重组蛋白Cre的诱导，未诱导，纯化);B:纯化蛋白的体外活性检测，以含有识别位点1xp的载体pLoxp_ccre629作为反应底物,Control:质粒对照；H+B:Hind III和EcoR I酶切；N:NCre酶切；C:CCre酶切；N+C:NCre和CCre酶切；Cre:Cre蛋白酶切；MBP:MBP蛋白酶切对照。图3:转基因毛状根的⑶S组织染色。其中a为转pCA-LoxP株系；b为转pCA-NCre株系；c为转pCA-nNCre株系；d为转pCA-CCre 株系；e 为转 pCA-nCCre 株系；f 为转 pCAMBIA1305.1 株系；g 为转 pCA-Cre 株系；h 为转 pCA-nCre 株系；i 为转 pCA_CCre_nNCre 株系；j 为转 pCA-nCCre_nNCre 株系。图4:删除效率统计分析结果。图5:转基因毛状根的PCR分子检测。其中A:以转基因株系 pCAMBIA1305.1、pCA-LoxP、pCA-Cre、pCA-nCre、pCA-CCre-nNCre、pCA-nCCre-nNCre烟草毛状根基因组DNA为模板，用测序引物pCA_F和PCA-R进行删除前后的PCR检测；N:阴性(删除前)；P:阳性(删除后)；B:以转pCA-NCre、pCA-nNCre、pCA-CCre、pCA-nCCre的不同株系的毛状根基因组DNA为模板，用测序引物pCA-F和pCA-R进行PCR检测。图6:测序分析结果。
具体实施例方式本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。实施例1重组酶Cre的拆分根据Johannes Hirrlinger等人的研究,将完整的重组酶Cre从第59和60个氨基酸之间进行拆分，分别命名为NCre和CCre，同时在各个拆分片段之前融合核定位信号NLS(图1)。实施例2拆分蛋白NCre、CCre以及完整重组蛋白Cre的体外诱导表达、纯化和活性检测原核表达载体构建设计扩增NCre 的上游引物:5’ -CGGAATTCATGTCCAATTTACTGACCGTAC-3，,下划线为EcoRI 识别位点，下游引物:5’ -CCCAAGCTTCTAATTCAACTTGCACCATGCC-3’,下划线为 HindIII识别位点；扩增CCre的上游引物:5 ’ -CGGAATTCATGAACCGGAAATGGTTTCCCG-3 ’，下划线为EcoRI 识别位点，下游引物:5’-CCCAAGCTTCTAATCGCCATCTTCCAGCA-3，，下划线为 HindIII 识别位点，以pET-Cre (含有Cre基因)为模板，PCR扩增NCre和CCre的体系50 μ 1:
权利要求
1.一种改造重组酶Cre的方法，其特征在于，其包括以下步骤: (1)将重组蛋白Cre在第59和60个氨基酸之间直接拆分为无活性的N端(NCre)和C端(CCre)两部分，在各个拆分片段之前融合核定位信号NLS ； (2)将拆分蛋白NCre和CCre构建到原核表达载体pMAL_C2X上，诱导表达纯化之后，体外检测拆分蛋白的活性； (3)将含有一对同向识别位点1xp的融合基因loxP-nos-loxP构建于pCAMBIA1305.1上得到中间载体pCA-LoxP，以此载体为骨架将拆分蛋白NCre和CCre构建上去，得到含有Cre/loxp系统的植物表达载体； (4)将构建的植物表达载体通过发根农杆菌介导的遗传转化转化模式植物烟草，获得转基因毛状根，通过⑶S组织染色和PCR分子检测改造的Cre/loxp系统的重组活性。
2.根据权利要求1所述的改造重组酶Cre的方法，其特征在于，所述含有一对同向识别位点1xp的融合基因loxP-nos-loxP是这样获得的:采用人工合成融合片段loxP-nos-loxP,序列如下:5’ -CGGGATCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTTCCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTT CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCCG-3>,下划线分别为BamH 1、Bgl I1、BamH I识别位点，将其用BamH I从pES载体上切下后连接到Bgl II酶切的载体pCAMBIA1305.1上，获得的阳性克隆进行测序验证，测序正确的质粒命名为pCA-LoxP，该载体中包括多克隆位点和⑶S报告基因。
3.根据权利要求2所述的改造重组酶Cre的方法，其特征在于，含Cre/loxp系统的植物表达载体的构建方法如下:用Bgl II酶切载体pCA-LoxP，将用BamH I /BglII双酶切后胶回收的片段NCre和nNCre分别连接到载体上，获得载体pCA_NCre和pCA_nNCre ;再将融合片段35S-CCre-nos和35SNLS_CCrenos用EcoR I和Hind III从载体pCXSN上切下后连接到pCA-nNCre的多克隆位点，从而获得载体pCA-CCre-nNCre和pCA-nCCre_nNCre ;同时融合片段 35S-CCrenos 和 35S-NLS-CCre_nos 用 EcoR I and Hind III从载体 pCXSN 上切下后连接到pCA-LoxP上得到载体pCA-CCre和pCA-nCCre。
4.根据权利要求1、2或3所述的改造重组酶Cre的方法，其特征在于，体外蛋白实验证明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的时候具有完整的Cre蛋白的活性。
5.根据权利要求1、2或3所述的改造重组酶Cre的方法，其特征在于，将拆分蛋白NCre和CCre分别构建的Cre/loxp系统转化模式植物烟草后发现当N端和C端(即NCre和CCre)在同一个植物细胞时恢复重组活性而发生删除，反之则不能。
6.如权利要求1、2或3中所述的改造重组酶Cre的方法，其特征在于，将核定位信号NLS与拆分蛋白融合后的Cre/loxp系统的删除效率明显提高。
7.权利要求1-6之一所述的改造后的重组酶Cre在植物中的应用。
全文摘要
一种改造重组酶Cre的方法及其在植物中的应用，它涉及将重组蛋白Cre拆分为无活性的N端(NCre)和C端(CCre)两部分，并且对拆分蛋白进行体外原核表达和活性检测，同时分别构建新的Cre/loxp系统，将其应用于植物当中，实现了当N端和C端在同一个植物细胞时恢复重组活性而发生删除，反之则不能。本发明还包括核定位信号NLS对该系统的影响以及所有的植物表达载体和体外原核表达载体。
文档编号C12Q1/68GK103146818SQ201310052609
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者高渊, 罗克明, 文梦玲, 汪丽君, 李超锋 申请人:西南大学