1.一种高脂血症风险关联基因多态性检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取DNA模板
采用DNA提取试剂盒抽提DNA,该试剂盒包括:检测APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)以及MTHFR基因上C677T(rs1801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物及测序引物;
2)PCR扩增反应
使用试剂盒中的PCR反应体系,该PCR反应体系包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR buffer和ddH2O;
反应条件为:94℃预变性3min,94℃变性30秒,退火30秒,72℃延伸1min,扩增35个循环,72℃最后延伸10min,保存于4℃;
3)PCR扩增产物纯化
使用试剂盒中的PCR产物纯化体系,该PCR产物纯化体系包括SAP酶、Exo I酶和ddH2O;
在PCR扩增仪上进行反应,反应条件为37℃15min,72℃20min;
4)DNA测序:
测序反应体系包含PCR纯化产物、25%BigDye mix、3.2uM DNA测序引物、去离子水;
在PCR扩增仪上进行反应:98℃2min,进行25个循环的96℃30秒,55℃30秒,60℃4min;
反应结束后加入125mM EDTA溶液和100%乙醇溶液于室温下沉淀15min;在4℃下,3600rpm/min离心30min,轻轻倒去上清液,加入70%乙醇溶液,3600rpm/min离心15min,倒去上清液,室温放置20min后,加入HIDI溶液,放入测序仪中;
5)基因型分析
通过测序图谱即可直接读出SNP位点基因型。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中,PCR反应体系的体积以25μL计,其组分及含量为:5×PCR buffer 5μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL,2.5mM dNTP混合液2μL,ddH2O 10.75μL,10μM上下游引物各2.5μL,DNA模板2μL。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤2)中,APOE基因上C112R和R158C的退火温度为63℃,LPL基因上HindⅢ的退火温度为57℃,MTHFR基因上C677T的退火温度为57℃。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤3)中,PCR产物纯化体系的体积以25μL计,其组分及含量为:20μLPCR产物,1U/μL SAP酶0.75μL,10U/μL Exo I酶0.375U/μL,ddH2O 3.875μL。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤4)中,测序反应体系的总体积以5μL计,其组分及含量为:PCR纯化产物1μL、25%BigDye mix1μL,3.2uM DNA测序引物1μL,去离子水2μL,125mM EDTA溶液1μL,100%乙醇溶液15μL,70%乙醇溶液30μL,HIDI溶液8μL。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤4)中,各基因测序引物为:
APOE(C112R/R158C):5′-CACTGTGCGACACCCTCCCC-3′;
LPL(HindⅢ):5′-TCATTTGGCACTGTTTCTTGC-3′;
MTHFR(C677T):5′-TCAAGGCAGGACAGTGTGGGAGTTC-3′。