专利名称：针对肿瘤坏死因子－α的单结构域抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了多肽，其含有针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的一个或多个单结构域抗体。本发明还涉及它们用于诊断和治疗的用途。这些抗体可以具有与人框架序列高度同源的框架序列。描述了仅含有肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体或者其与其他药物联合的组合物。
背景技术：
认为肿瘤坏死因子α(TNF-α)在各种疾病，例如，在炎性疾病如类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎和多发性硬化中起重要作用。已经很详细地研究了TNF-α和受体(CD120a，CD120b)。生物活性形式的TNF-α是三聚体并且通过邻近亚单位形成的沟对于细胞因子-受体相互作用是重要的。已经开发了拮抗细胞因子的作用的一些策略并且这些策略当前被用于治疗各种疾病状态。
对TNF-α具有足够特异性和选择性的TNF-α抑制剂可以是有效的预防或治疗性药物化合物，其用于预防或治疗某些疾病，其中TNF-α被暗示作为病因。已经描述了通过针对TNF-α的抗体治疗毒性休克(EP 486526)、肿瘤退化、细胞毒性抑制(US 6448380，US 6451983，US 6498237)、自身免疫疾病如RA和局限性回肠炎(EP 663836，US 5672347，US 5656272)、移植排斥宿主反应(US 5672347)、细菌性脑膜炎(EP 585705)的方法。
然而当前可利用的药物没有一种可以完全有效治疗自身免疫病，并且多数受到严重毒性的限制。此外，开发对这种靶序列具有足够潜能和选择性的新的化学实体(NCE)是极端困难和漫长的过程。另一方面基于抗体的治疗剂具有作为药物的重要潜力，因为对它们的靶标具有异常的特异性和低的内在毒性。此外，当与开发新的化学实体(NCE)相比时，开发时间可以显著缩短。然而，当配体的受体-结合结构域嵌入在沟中时(TNF-α就是这样)，难以针对多聚体蛋白产生常规抗体。本发明中描述的重链抗体来自骆驼科，公知该这些抗体具有腔结合倾向(WO 97/49805；Lauwereys等人EMBO J.17，5312，1998))。因此，这种重链抗体内在地适于结合诸如TNF的配体的受体结合结构域。此外，公知这种抗体长期保持稳定，因此，增加了它们的保存期限(Perez等人，Biochemistry，40，74，2001)。此外，使用与哺乳动物细胞培养发酵相比廉价的表达系统，如酵母或其他微生物在发酵罐中“一起”产生这种重链抗体片段(EP 0 698 097)。
使用来自诸如小鼠、绵羊、山羊、兔等等来源的抗体和其人源化衍生物治疗需要调节炎症的病症由于几个原因存在问题，。常规抗体在室温下不稳定，并且必须冷冻制备和保存，需要必要的冷冻实验室设备、保存和运输，这消耗了时间和费用。冷冻有时在发展中国家中是不可行的。此外，所述抗体的生产或者小规模产生是昂贵的，因为表达完整和由活性的抗体所需的哺乳动物细胞系统需要时间和设备的高水平支持，并且产率非常低。此外，常规抗体的大尺寸将限制，例如，发炎组织部位的组织渗透。此外，常规抗体的结合活性依赖于pH，并因此不适于用于通常生理pH范围之外的环境中诸如，例如，治疗胃出血、胃手术。而且，常规抗体在低或高pH下不稳定并因此不适于经口施用。然而，已经阐明骆驼科抗体抗严酷的条件，如极端pH、变性试剂和高温(Dumoulin等人，Protein Science11，500，2002)，因此使得它们适于通过经口施用递送。此外，常规抗体具有结合活性，其取决于温度，因此不适于用于在生物活性温度范围(例如，37±20℃)之外的温度下实施的测定或试剂盒。
多肽治疗剂，尤其基于抗体的治疗剂具有作为药物的重要潜力，因为它们具有对它们的靶标的异常特异性和低的内在毒性。然而，技术人员公知已得到的针对治疗上有用的靶标的抗体需要额外的修饰以准备将其用于人的治疗，从而避免当施用于人时在人个体中发生的不想要的免疫学反应。该修饰过程通常被称为“人源化”。技术人员公知在不同于人的物种产生的抗体需要人源化以便使得该抗体可用于人的抗体治疗((1)CDR嫁接Protein Design LabsUS 6180370，US 5693761；Genentech US6054297；Celltech460167，EP 626390，US 5859205；(2)贴面(veneering)XomaUS 5869619，US 5766886，US 5821123)。需要一种产生抗体的方法，该方法避免了对实质人源化的需要，或者完全不需要人源化。需要一类新的抗体，这些抗体具有明确的框架区或者氨基酸残基并且可被施用于人受试者而不需要实质人源化，或者根本不需要人源化。
常规抗体的另一个重要的缺陷是它们是复杂的大分子并且因此相对不稳定，并且它们对蛋白酶降解敏感。这意味着常规抗体药物不能经口、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或者吸入施用，因为它们不能抵抗这些部位的低pH、这些部位和血液中蛋白酶的作用和/或因为它们的大尺寸。它们必须通过注射(静脉内、皮下，等)施用以克服这些问题的若干问题。通过注射施用需要专家训练以便正确和安全地使用皮下注射器或针。还需要无菌设备、治疗性多肽的液体制剂、所述多肽无菌和稳定形式的小瓶包装，和对于受试者，需要针进入的适合部位。此外，在接受注射前和注射时受试者通常经历生理和心理上的压力。因此，需要一种递送治疗多肽的方法，该方法避免了对注射的需要，该方法不仅节省费用/时间，而且对受试者更方便和更舒适。
基于单结构域的抗体治疗具有作为药物的重要潜力，因为它们具有对它们的靶标的异常特异性和低的内在毒性。然而，进一步提高它们的内在和功能亲合力导致对患者的许多益处，如更小的治疗剂量、更快的治疗，和更小的副作用。
发明目的本发明的目的是提供包含结合TNF-α的一个或多个单结构域抗体的多肽、所述多肽的同系物、所述多肽的同系物的功能部分。所述多肽结合TNF-α时改变TNF-α的生物学活性。所述多肽可以结合到TNF-α的受体-结合沟，或者可以不结合到受体结合沟中。这种多肽是单结构域抗体。
本发明的另一个目的是提供单结构域抗体，其可以是本领域中任一种单结构域抗体或者任一将来的单结构域抗体。实例包括，但不限于，重链抗体、天然没有轻链的抗体、从常规4-链抗体衍生的单结构域抗体、工程化抗体和单结构域支架，其不同于从抗体衍生的那些支架。根据本发明的一个方面，如此处所用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，其已知为缺少轻链的重链抗体(WO 9404678)。为了阐明，从缺少轻链的重链抗体衍生的该可变结构域被称为VHH或者nanobody以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别。这种VHH分子可以来自在骆驼科(Camelidae)物种，例如在骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和驮马中产生的抗体。
本发明的另一目的是提供静脉内、皮下、经口、舌下、局部、经鼻、阴道、直肠或通过吸入施用抗-TNF-α多肽的方法。
本发明的另一目的是增强单价单结构域抗体的结合亲合力。
发明概述本发明的一个实施方案是含有至少一种抗-TNF-α单结构域抗体的抗TNF-α多肽。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中单结构域抗体相应于SEQ ID NOs1到16和79到84任一个代表的序列。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其还含有针对血清蛋白至少一种单结构域抗体。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、运铁蛋白、或血纤蛋白原之一。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中单结构域抗血清蛋白单结构域抗体相应于SEQ ID NOs26到29和85到97任一个代表的序列。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其相应于SEQID NOs30到43之一代表的序列。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其还含有选自抗-IFN-γ单结构域抗体、抗-TNF-α受体单结构域抗体和抗-IFN-γ受体单结构域抗体的至少一种单结构域抗体。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中针对TNF-α的单结构域抗体的数目为至少2个。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其相应于SEQID NOs73到76之一代表的序列。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗TNF-α多肽，其中至少一个单结构域抗体是人源化的骆驼科VHH。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中人源化骆驼科VHH相应于SEQ ID NOs17到19和21到24之一代表的序列。
本发明的另一实施方案是组合物，其含有如上描述的抗TNF-α多肽和来自抗-IFN-γ单结构域抗体、抗-TNF-α受体单结构域抗体和抗-IFN-γ受体单结构域抗体的至少一种单结构域抗体，用于同时、分开或顺序地施用于受试者。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的组合物，其中至少一种抗-IFN-γ单结构域抗体相应于SEQ ID NOs44到72之一代表的序列。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的组合物，其中所述单结构域抗体是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的组合物，其中抗TNF-α多肽是全长抗TNF-α多肽的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的组合物，其中至少一种单结构域抗体是骆驼科VHH。
本发明的另一实施方案是编码如上述抗TNF-α多肽的核酸。
本发明的另一实施方案是鉴定一种试剂的方法，该试剂调节如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合，该方法包括步骤(a)将如上描述的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合降低，将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合。
本发明的另一实施方案是鉴定一种试剂的方法，该试剂通过如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病，该方法包括(a)将如上描述的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合降低，将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病。
本发明的另一实施方案是鉴定一种试剂的方法，该试剂通过如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合调节肿瘤坏死因子-α与其受体的结合，该方法包括(a)将如上描述的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时，在所述候选调节剂的存在下结合降低，将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α与其受体的结合。
本发明的另一实施方案是筛选调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病的试剂的试剂盒，该试剂盒含有如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α。
本发明的另一实施方案是通过根据上述方法鉴定的一种未知试剂，该试剂调节如上描述的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合。
本发明的另一实施方案是通过根据上述方法鉴定的一种未知试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病。
本发明的另一实施方案是如上描述的一种未知试剂，其中所述疾病是炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化的一种或多种。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽、或者如上描述的核酸、或者如上描述的组合物，或者如上描述的试剂，它们用于治疗和/或预防和/或减轻与炎症过程有关的疾病。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的核酸、或者如上描述的组合物，或者如上描述的试剂的用途，用于制备治疗和/或预防和/或减轻与炎症反应有关的疾病的药物。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该物质能够穿过胃环境而该物质不被失活。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗，预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病症状的药物，该物质能够穿过胃环境而该物质不被失活。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病症状的药物，该TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该TNF-α调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜的渗透性。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病症状的药物，该TNF-α调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜的渗透性。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病症状的药物，该TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，该TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病症状的药物，该TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
本发明的另一实施方案是如上描述的方法、如上描述的试剂盒、如上描述的核酸或试剂、如上描述的核酸或试剂的用途、如上描述的组合物、如上描述的组合物的用途、如上描述的抗-TNF-α多肽、如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，其中所述疾病是炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、多发性硬化、阿狄森氏病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、肾小球性肾炎、突眼性甲状腺肿、急性热病性多神经炎、淋巴瘤性甲状腺肿、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、斯耶格伦综合征、脊柱关节病(spondyloarthropathies)、甲状腺炎，和脉管炎之一。
本发明的另一实施方案是组合物，其含有如上描述的核酸或试剂、如上描述的抗-TNF-α多肽、或者如上描述的组合物，和适宜的药物载体。
本发明的另一实施方案是特征为肿瘤坏死因子-α的机能障碍的疾病的诊断方法，该方法包括(a)将样品与如上描述的抗-TNF-α多肽接触，(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和(c)将步骤(b)中所检测到的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合中的差异可以诊断特征为肿瘤坏死因子-α的机能障碍的疾病。
本发明的另一实施方案是使用如上描述的方法筛选如上引用的疾病的试剂盒。
本发明的另一实施方案是筛选如上引用的疾病的试剂盒，该试剂盒含有分离的如上描述的抗-TNF-α多肽。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，用于纯化所述肿瘤坏死因子-α。
本发明的另一实施方案是如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，用于抑制肿瘤坏死因子-α和一种或多种肿瘤坏死因子-α受体之间的相互作用。
本发明的另一实施方案是产生如上描述的抗-TNF-α多肽的方法，该方法包括步骤(a)得到编码针对肿瘤坏死因子-α的骆驼科VHH的双链DNA，(b)克隆和表达步骤(b)中所选的DNA。
本发明的另一实施方案是产生如上描述的抗-TNF-α多肽的方法，该方法包括步骤(a)在允许该多肽表达的条件下培养含有能够编码如上描述的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主细胞，和(b)从培养物回收所产生的多肽。
本发明的另一实施方案是如上描述的方法，其中所述宿主细胞是细菌或酵母。
本发明的另一实施方案是含有如上描述的抗-TNF-α多肽的试剂盒，该试剂盒用于筛选炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征或多发性硬化的任一种。
附图和附表简述
图1如实施例1中描述的抗人TNF VHH的对比。
图2根据实施例1的ELISA中检验的抗人TNF-αVHH的稀释系列。
图3使用根据实施例1的人细胞系KYM在细胞毒性测定中测量的VHH的拮抗作用。
图4野生型VHH#12B和突变体A74S+Y76N+K83R+P84A的体外受体结合测定。
图5野生型VHH#12B和突变体1E+Q5LA74S+Y76N+K83R+P84A的体外受体结合测定。
图6野生型VHH#3E和突变体VHH的ELISA中的结合。
图7野生型VHH#3E和突变体VHH的体外受体结合测定。
图8如实施例3中描述的拮抗性抗小鼠TNF的对比。
图9使用根据实施例3的鼠细胞系L929在细胞毒性测定中测量的抗小鼠TNF VHH的拮抗作用。
图10用于产生二价或双特异VHH的载体pAX11(pUC119主链)的EcoRI-HindIII插入片段。
图11IMAC纯化的单价-(泳道8)、二价-(泳道1)、三价-(泳道2、3、和5)和四价(泳道4、6和7)抗-TNF a VHH的考马斯染色的PAGE(15％)。
图12通过单价-、二价-、三价和四价VHH在Superdex 75HR上的凝胶过滤分析的层析图。
图13抗人TNF VHH的单价-、二价-、三价和四价形式与临床使用的产品英夫利昔单抗(Remicade)和依那西普(Enbrel)的拮抗特征的比较。
图14针对小鼠TNFα的单价-和二价VHH的拮抗行为。
图15来自实施例4中描述的人IgG1的VHH-Fc-融合物的考马斯染色的PAGE。
图16在生物测定中确定的与VHH#3E的二价形式相比VHH#3E衍生的VHH-Fc融合物的拮抗效能。
图17参比和胃蛋白酶处理的TNF3E在pH 2.2、pH 3.2和pH 4.2下的ELISA(100％是在1/100稀释下测量的信号)。
图18实验设置表1针对TNF-α的本发明各方面的肽的氨基酸序列。
表2用于VHH#12B的诱变的诱变反应、诱变引物和模板的列表。
表3用于VHH#3E的诱变的诱变反应、诱变引物和模板的列表。
表4人源化和野生型VHH的概况。
表5抗小鼠血清清蛋白/抗TNF-α。
表6针对人IFN-γ的VHH的氨基酸序列表。
表7针对TNF-α的二价(BIV 3E，BIV#m3F)、三价(TRI3E)或四价(TETRA 3E)VHH的序列。
表8本发明的抗小鼠血清清蛋白VHH的氨基酸序列之间的部分同源性。
表9本发明的抗-TNF-αVHH间的部分同源性。
表10本发明的抗-IFN-γVHH的之间的百分比同源性。
表11治疗程序表详述本发明涉及抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)多肽，其含有针对TNF-α的一个或多个单结构域抗体。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。
单结构域抗体是这样的抗体，它们的互补决定区是单结构域多肽的部分。实例包括，但不限于，重链抗体、天然没有轻链的抗体、从常规4-链抗体衍生的单结构域抗体、工程化抗体和单结构域支架，其不同于从抗体衍生的那些支架。单结构域抗体可以是本领域中任一种单结构域抗体或者任一将来的单结构域抗体。单结构域抗体可以来自任何物种，包括，但不限于，小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。根据本发明的一个方面，此处所用的单结构域抗体是称作无轻链的重链抗体的天然存在的单结构域抗体。这种单结构域抗体在例如WO 94/04678中描述。为了阐明，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的该可变结构域被称为VHH或者nanobody，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别。这种VHH分子可以来自在骆驼科物种，例如在骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和驮马中产生的抗体。除了骆驼科之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体；这种VHHs在本发明的范围内。
根据本发明并且技术人员公知的VHHs是从天然缺少轻链的免疫球蛋白衍生的重链可变结构域，如WO 94/04678中描述的从骆驼科衍生的那些(此后称作VHH结构域或nanobodies)。VHH分子小于IgG分子约10倍。它们是单一多肽并且非常稳定，抗极端pH和温度条件。此外，它们抗蛋白酶的作用，而常规抗体却不能抗蛋白酶作用。此外，VHHs的体外表达产生高产率的、正确折叠的功能VHHs。此外，在Camelids中产生的抗体将识别某些表位，这些表位不同于通过使用抗体文库在体外产生的抗体或者通过免疫不同于Camelids的哺乳动物产生的抗体所识别的表位(WO 9749805)。同样，抗-TNF-αVHH可以比常规抗体更有效地与TNF-α相互作用，从而更有效地阻断其与TNF-α受体的相互作用。
根据本发明，TNF-α来自任何物种。与本发明相关的物种的实例包括兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、骆驼、美洲驼、猴子、驴、豚鼠、猪、鸡、绵羊、狗、猫、马，和优选地人。
TNF-α也是TNF-α的片段，其能够引起免疫应答。TNF-α也是TNF-α的片段，其能够结合针对全长TNF-α产生的单结构域抗体。
针对TNF-α的单结构域抗体指单结构域抗体，其能够以好于10-6M的亲合力结合TNF-α。
本发明的一个实施方案是抗-TNF多肽，其中单结构域抗体含有针对TNF-α的骆驼科VHH。
针对TNF-α的抗TNF多肽的一个或多个单结构域抗体可以是相同的序列。备选地，它们可以并非全部具有相同的序列。在本发明的范围内，抗-TNF多肽含有抗-TNF-α单结构域抗体，这些抗体不都具有相同的序列，但是它们针对相同的靶标、其一种或多种抗原。
本发明的另一实施方案是抗-TNF-α多肽，其中单结构域抗体相应于如表1中所示的SEQ ID NOs1到16和79到84之一代表的序列。所述序列来自骆驼科重链抗体(VHHs)，这些抗体针对TNF-α。
本发明还涉及抗-TNF-α多肽，其中所述单结构域抗体是针对TNF-α的VHH，其中VHH属于具有类似人序列的类别。该类别的特征在于VHHs在45位携带选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的一个氨基酸，如，例如，L45，并且在103位的携带色氨酸(根据Kabat编号)。本发明中描述的骆驼科单结构域抗体的新类别(表1，实施例1)由VHH#2B(SEQ ID NO3)和VHH#12B(SEQ ID No.14)代表，它们在FR2中含有疏水残基并且在103位为疏水残基色氨酸。
在WO03035694中已描述了由序列VHH#1A(SEQ ID NO.1)、VHH#4B(SEQ ID NO.12)、VHH#8-29(SEQ ID NO.81)、VHH#8-41(SEQID NO.82)、VHH#8-42(SEQ ID NO.83)和VHH#8-44(SEQ ID NO.84)(表1，实施例1)代表的骆驼科单结构域抗体的另一个类似人的类别，并且这些抗体含有通常在人来源或者来自其他物种的常规抗体中发现的疏水FR2残基，但是通过103位上的带电精氨酸弥补了亲水性的损失，该精氨酸残基置换了来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基。同样，属于这两类的肽显示出与人VH框架区的高度氨基酸序列同源性，并且所述肽可以被直接施用于人而不会预期出现不想要的免疫应答，并且没有进一步人源化的负担。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。
因此，本发明的一方面允许对需要其的患者直接施用抗-TNF-α多肽，其中单结构域抗体属于VHH的人源化类别，并且含有由SEQ ID NO1、3、12、14、81、82、83、和84之一代表的序列。
本发明所用的VHHs的任一种可以是常规类别或者类似人的骆驼科抗体类别。所述抗体可以针对完整TNF-α或者其片段，或者其同源序列的片段。这些多肽包括全长骆驼科抗体，即Fc和VHH结构域，重链骆驼科抗体与人Fc结构域的嵌合形式或者VHH自身或者衍生的片段。
抗血清清蛋白VHH可以以比常规抗体更有效的方式与血清清蛋白相互作用，公知血清清蛋白是载体蛋白。作为载体蛋白，血清清蛋白的一些表位不能被结合的蛋白、肽和小分子化合物接近。因为公知VHH结合到“不寻常的”或者非常规表位如腔(WO 97/49805)中，所以这种VHH与循环的清蛋白的亲合力可以被增加。
本发明还涉及如下发现如此处描述的抗-TNF多肽还含有针对受试者的一种或多种血清蛋白的一个或多个单结构域抗体，与不是所述构建体的部分的抗TNF-α单结构域抗体的半寿期相比，该抗-TNF多肽在所述受试者中循环半寿期令人惊奇地显著延长。这些多肽的实例在表5中通过SEQ ID NOs30到43代表。此外，发现所述多肽显示出单结构域抗体的相同的有利性质，诸如在小鼠中保持完整的高稳定性、极端pH抗性、高温稳定性和高靶标亲合力。
本发明的另一实施方案是还含有针对一种或多种血清蛋白的一个或多个单结构域抗体的抗-TFN-α多肽，所述抗-TFN-α多肽含有由SEQ IDNOs30到43(表5)任一个代表的序列。
本发明的另一实施方案是抗-TFN-α多肽，其中抗血清蛋白单结构域抗体相应于如表5中SEQ ID NOs26到29和85到97之一代表的序列。
血清蛋白可以是受试者血清中发现的任一适宜的蛋白。在本发明的一方面，血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、运铁蛋白、或血纤蛋白原。根据所计划的用途，如有效治疗所要求的半寿期和/或靶抗原的区室化，VHH-配偶体可以针对上面的血清蛋白之一。
本发明的另一方面是如此处公开的抗-TFN-α多肽，其还含有至少一个多肽，所述多肽选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽。
本发明的一个实施方案是针对IFN-γ的单结构域抗体相应于如表6中所示的SEQID NOs44到72任一个代表的序列。
根据本发明的一方面，单结构域抗体针对TNF-α受体。所述单结构域抗体可以是骆驼科VHH。
根据本发明的一方面，单结构域抗体是针对IFN-γ受体。所述单结构域可以是骆驼科VHH。
本发明的另一方面是治疗如此处引用的自身免疫疾病或病症的方法，该方法包括对患者施用有效量的抗-TNF-α多肽，该多肽还含有选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽的至少一种多肽，这些多肽如下面描述相互连接。
这种多特异性构建体可以比单特异性构建体具有作为炎症治疗化合物的更大的潜能。
本发明的一方面是组合物，该组合物含有如此处公开的抗-TNF-α多肽和选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽的至少一种多肽，用于同时、分开或顺序施用于受试者。
本发明的一方面是治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括对个体同时、分开或顺序地施用有效量的抗-TNF-α多肽和选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽的至少一种多肽。
本发明的另一方面是试剂盒，其含有用于同时、分开或顺序施用于受试者的抗-TNF-α多肽和选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽的至少一种多肽。本发明的一个方面是可以根据本发明使用的试剂盒。本发明的一方面是试剂盒可用于治疗此处引用的疾病。
同时施用指多肽同时施用于受试者。例如，作为多肽混合物或者包含所述多肽的组合物。实例包括，但不限于静脉内施用的溶液、片剂、液体、局部霜剂，等等，其中每种制剂都含有目标多肽。
分开施用指多肽在同时或者基本上相同的时间被施用于受试者。这些多肽作为单独的、未混合的制剂存在于试剂盒中。例如，不同的多肽可作为单独的片剂存在于试剂盒中。通过同时或者一个片剂接一个地吞咽将片剂施用于受试者。
顺序施用指多肽被顺序施用于受试者。多肽作为单独的、未混合的制剂存在于试剂盒中。制剂之间存在时间间隔。例如，一种多肽可以在另一组分施用后长达336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1、或0.5小时时被施用。
在顺序施用中，一种多肽可以在另一多肽施用之前和/或之后施用一次，或者任一次数并且以各种剂量施用。顺序施用可以与同时或顺序施用联合。
下述抗-TNF-α多肽的医学应用还应用于含有如此处公开的抗-TNF-α多肽和选自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受体多肽和抗-IFN-γ受体多肽的至少一种多肽的组合物，用于同时、分开或顺序施用于如上文中公开的受试者。
根据本发明的一方面，抗IFN-γ多肽抗TNF-α单结构域抗体针对IFN-γ。所述单结构域抗体可以是骆驼科VHH。
本发明的一个实施方案是针对IFN-γ的单结构域抗体相应于如表6中所示的SEQ ID NOs44到72之一代表的序列。
根据本发明的一方面，抗TNF-α单结构域抗体针对TNF-α受体。所述单结构域抗体可以是骆驼科VHH。
根据本发明的一方面，抗IFN-γ受体多肽抗TNF-α单结构域抗体针对IFN-γ受体。所述单结构域抗体可以是骆驼科VHH。
本发明的另一实施方案是如此处公开的抗TNF-α多肽，其中针对TNF-α的单结构域抗体的数目是两个或更多。这种多价抗TNF-α多肽与它们的单价对应物相比具有对靶标的不寻常的高功能亲合力、显示出比预期的抑制性质更高的抑制性质的优点。
多价抗-TNF-α多肽的功能亲合力比单价亲本抗-TNF-α多肽高几个数量级。本发明人已经发现这些多价多肽的功能亲合力比现有技术中关于二价和多价抗体所报导的亲合力高得多。令人惊奇地，本发明的抗-TNF-α多肽直接相互连接(SEQ ID No.77和78)或者通过短接头序列连接，这些多肽显示出对多价常规四链抗体理论上预测的高功能亲合力。
本发明人已经发现优选用由多结构域和多聚体蛋白组成的抗原，在直接结合测定或者功能测定，例如细胞毒性测定中可以检测这种显著增强的功能活性。
本发明的另一实施方案是如此处公开的抗-TNF-α多肽，其中针对TNFα的单结构域抗体的数目为两个或多个，所述抗-TNF-α多肽含有相应于SEQ ID NOs73到76任一个所代表的序列。
利用本领域中公知的方法或者任何将来的方法可以将单结构域抗体连接起来形成此处公开的任一多肽，该多肽含有一个以上的单结构域抗体。例如，通过化学交联将氨基酸残基与Blattler等人，Biochemistry24，1517-1524；EP294703所描述的有机衍生试剂反应可以将这些单结构域抗体融合。备选地，可以在DNA水平上基因融合单结构域抗体，即，形成多核苷酸构建体，其编码含有一个或多个抗靶标单结构域抗体和一个或多个抗血清蛋白单结构域抗体的完整多肽构建体。产生二价或多价VHH多肽构建体的方法在PCT专利申请WO 96/34103中公开。连接多个单结构域抗体的一种方法是通过基因途径将单结构域抗体编码序列直接连接或者通过肽接头连接。例如，第一个单结构域抗体的C-末端可以连接到下一个单结构域抗体的N-末端。可以将该连接模式扩展以便连接额外的单结构域抗体以构建和产生三功能构建体、四功能构建体，等等。
根据本发明的一个方面，单结构域抗体被直接相互连接，没有使用接头。与连接大体积的常规抗体(其中需要接头序列以保持两个亚单位中的结合活性)相反，本发明的多肽可以直接连接(SEQ ID No.77和78)，从而避免了接头序列的潜在问题，诸如施用于人类受试者时的抗原性、接头序列的不稳定导致亚单位解离。
根据本发明的另一方面，单结构域抗体通过肽接头序列相互连接。这种接头序列可以是天然存在的序列或者非天然存在的序列。预期接头序列在该抗-TNF-α多肽所施用的受试者中是非免疫原性的。接头序列可以对多价抗-TNF-α多肽提供足够的柔性，同时可以抗蛋白水解降解。接头序列的一个非限制性实例是可以衍生自WO96/34103中描述的VHHs的铰链区的接头序列。
根据本发明的另一方面，含有两个以上单结构域抗体的多价单结构域抗体可以直接或者通过接头序列相互连接。用常规抗体难以产生这种构建体并且由于大体积亚单位的空间位阻，功能性将丧失或者极大地减小，而不是与单价构建体相比用本发明的VHH所看到的功能性显著增加(对于这种多价VHH构建体的凝胶过滤分析，见图12)。
技术人员根据本领域中公知的方法或者任一种将来的方法可以制备此处公开的多肽构建体。例如，用本领域中公知的方法，如通过免疫骆驼和从骆驼得到杂交瘤，或者利用本领域中公知的分子生物学技术克隆单结构域抗体的文库并随后通过噬菌体展示选择可以得到VHH。
根据本发明的一方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列。根据本发明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽功能部分。根据本发明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列。根据本发明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全长抗-TNF-α多肽的同源序列的功能部分。根据本发明的一方面，抗-TNF-α多肽可以含有抗-TNF-α多肽的序列。
根据本发明的一方面，用于形成抗-TNF-α多肽的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体(例如，VHH)或者其同源序列。根据本发明的另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的功能部分。根据本发明的另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的同源序列。根据本发明的另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的同源序列的功能部分。
如文中所用的，本发明的同源序列可以含有一个或多个氨基酸的加入、缺失或置换，这些加入、缺失或置换不实质性地改变本发明多肽的功能特征。氨基酸缺失或置换的数目优选多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。
根据本发明的同源序列可以是通过氨基酸的加入、缺失或置换修饰的多肽，所述修饰与未修饰的多肽相比不实质上改变功能特征。
根据本发明的同源序列可以是通过氨基酸的加入、缺失或置换修饰的多肽，所述修饰与未修饰的多肽相比不实质上改变功能特征。
根据本发明的同源序列可以是存在于其他骆驼科物种如，例如，骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、驮马等中的序列。
当同源序列指出序列同一性时，其表示一个序列与亲本序列具有高度序列同一性(多于70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列同一性)并且优选特征为与亲本序列具有相似的性质，即亲合力，所述同一性为利用公知的方法计算得到。
备选地，同源序列还可以是根据下式从亲本序列的任何数目的位置上允许的置换得到的任一氨基酸序列Ser被Ser、Thr、Gly、和Asn置换；Arg被Arg、His、Gln、Lys、和Glu之一置换；Leu被Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、和Val之一置换；Pro被Pro、Gly、Ala、和Thr之一置换；Thr被Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、和Gln之一置换；Ala被Ala、Gly、Thr、和Pro之一置换；Val被Val、Met、Tyr、Phe、Ile、和Leu之一置换；Gly被Gly、Ala、Thr、Pro、和Ser之一置换；Ile被Ile、Met、Tyr、Phe、Val、和Leu之一置换；Phe被Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、和Leu之一置换；Tyr被Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、和Leu之一置换；His被His、Glu、Lys、Gln、Thr、和Arg之一置换；Gln被Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、和Arg之一置换；Asn被Asn、Glu、Asp、Gln、和Ser之一置换；Lys被Lys、Glu、Gln、His、和Arg之一置换；Asp被Asp、Glu、和Asn之一置换；Glu被Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、和Arg之一置换；Met被Met、Phe、Ile、Val、Leu、和Tyr之一置换。
根据本发明的同源核苷酸序列可以指50、100、200、300、400、500、600、800或1000个核苷酸以上的核苷酸序列，其在严格杂交条件(如Sambrook等人，Molecular Cloning，Laboratory Manuel，Cold Spring，HarborLaboratory出版社，New York中描述的杂交条件)下能够与能够编码亲本序列的核苷酸序列的反向互补序列杂交。
如文中所用的，功能部分指单结构域抗体的序列，该序列具有足够大小从而目标相互作用保持在亲合力为1×10-6M或更好。
备选地，功能部分含有完整氨基酸序列的部分缺失并且仍然保持结合靶标并与其相互作用所需的结合部位和蛋白质结构域。
如文中所用的，功能部分指完整序列的100％以下(例如，99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％，等)，但是含有5个或更多的氨基酸或者15个或更多核苷酸。
本文中所提到的靶标诸如TNF-α、TNF-α受体、血清蛋白(例如血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、运铁蛋白、血纤蛋白原)和IFN-γ、IFN-γ受体可以是所述靶标的片段。从而靶标也是所述靶标的片段，其能够引起免疫应答。靶标还是所述靶标的片段，其能够与针对全长靶标产生的单结构域抗体结合。
如本文中所用的片段指序列的100％以下(例如，99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％等)，但是含有5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段足够长从而目标相互作用保持在亲合力为1×10-6M或更好。
如本文所用的片段也指一个或多个氨基酸的任选插入、缺失和置换，这些插入、缺失和置换不实质性地改变靶标与针对野生型靶标产生的单结构域抗体结合的能力。氨基酸插入缺失或置换的数目优选多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。
本发明的同源序列可以包括已经被人源化的抗-TNF-α多肽。VHH的新类别的抗体的人源化将使施用时在人类个体中的不需要的免疫反应性的可能性进一步降低。
本发明的一个实施方案涉及制备基于美洲驼抗体的修饰的多肽的方法，通过确定抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，可以修饰抗体可变结构域而不减小该结构域对抗原的天然亲合力，而减小其关于异源物种的免疫原性可以实现该方法；还涉及用于施用于异源物种的在所鉴定的残基处具有修饰的VHHs的用途，还涉及如此修饰的VHH。
更具体地，本发明涉及修饰的VHHs的制备，为了施用于人而修饰该VHHs，还涉及所得VHH自身，和这种“人源化”VHHs在治疗人类的疾病的用途。人源化意味着突变，使得当施用于人类患者时免疫原性很小或者不存在。根据本发明，将多肽人源化包括将一个或多个骆驼科氨基酸用在人共有序列中发现的它们的人对应物置换，而该多肽不丧失其典型特征，即，该人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。这种方法是技术人员公知的。
骆驼科单结构域抗体的人源化需要在单个多肽链中导入和诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化需要在两条链——轻链和重链中导入氨基酸，还需要保留两条链的装配。
作为非限制性实例。将在FR2中包含类人残基的VHH#12B的多肽人源化。人源化需要诱变FR1中1和5位上的残基，其通过用于所有组成成分克隆的引物导入并且在美洲驼序列中不天然地存在。那些残基中的诱变不导致结合和/或抑制活性的损失。人源化还需要在FR3中74、76、83、84、93位上残基的诱变。那些残基中的诱变不导致结合和/或抑制活性的显著损失(见图4)。因此联合FR1和FR3的突变不影响结合和/或抑制活性(图5)。人源化还需要在FR4中108位上的诱变。Q108L的诱变导致在大肠杆菌中生产水平降低。108位在camelid VHH中暴露于溶剂，而在人抗体中，该位置被埋藏在VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分离的VHs中，108位暴露于溶剂。导入非极性疏水Leu而不是极性未带电的Gln可以对该分子的内在折叠/稳定性具有显著影响。
作为非限制性实例，将VHH#3E中所代表的多肽人源化，VHH#3E中所代表的多肽在37、44、45和47位上含有camelid标志性残基，它们具有亲水特征。在44和45位通过人疏水残基置换亲水残基(E44G和R45L)对结合和/或抑制没有影响。然而，当导入F37V和F47W时，观察到结合和/或抑制活性的损失。建模数据证明残基37对于保持CDR3环构象的完整性从而对于活性的保持是关键的(见图6)(所有编号都根据Kabat)。
SEQ ID NO3和14显示出与人VH框架区的90％以上的氨基酸序列同源性并且因此所述VHH可以直接施用于患者而不预期从中产生免疫应答，并且没有额外的人源化负担。因此，本发明的一方面允许对需要该治疗的患者直接施用含有SEQ ID NO3和14的多肽、其同源序列，或者其同源序列的功能部分。
本发明的一个实施方案是人源化VHH的方法，该方法包括单独或联合置换下面的残基之一FR1位置1、5、28和30，FR2中44和45位标志氨基酸，FR3残基74、75、76、83、84、93和94，和FR4中103、104、108和111位；根据Kabat编号方法编号。
本发明的一个实施方案是抗-TNF-α多肽，或者能够编码所述多肽的核酸，它们用于治疗、预防和/或减轻与炎症过程有关的疾病的症状。TNF-α与炎症过程有关，并且TNF-α作用的阻断具有抗炎症作用，该抗炎症作用在某些疾病状态诸如，例如，局限性回肠炎中是非常理想的。我们的实施例阐明了根据本发明的VHHs，它们结合TNF-α并且阻断其与TNF-α受体的结合。
本发明的抗TNF-α多肽可应用于自身免疫病，如阿狄森氏病(肾上腺)、耳朵的自身免疫疾病(耳朵)、眼睛的自身免疫疾病(眼睛)、自身免疫肝炎(肝)、自身免疫腮腺炎(腮腺)、局限性回肠炎(肠)、I型糖尿病(胰腺)、附睾炎(附睾)、肾小球性肾炎(肾)、突眼性甲状腺肿(甲状腺)、急性热病性多神经炎(神经细胞)、淋巴瘤性甲状腺肿(甲状腺)、溶血性贫血(红细胞)、系统性红斑狼疮(多种组织)、男性不育症(精液)、多发性硬化(神经细胞)、重症肌无力(神经肌肉接点)、天疱疮(主要是皮肤)、牛皮癣(皮肤)、风湿热(心脏和关节)、类风湿性关节炎(关节衬里)、肉样瘤病(许多组织和器官)、硬皮病(皮肤和结缔组织)、斯耶格伦综合征(外分泌腺、及其他组织)、脊柱关节病(中轴骨骼、及其他组织)、甲状腺炎(甲状腺)、脉管炎(血管)。括号内是受疾病影响的组织。该自身免疫疾病列表是代表性而非包括的。
本发明的抗-TNF-α多肽适用的自身免疫病症包括，例如，AIDS、特异反应性过敏、支气管气喘、湿疹、麻风、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织和器官的移植、慢性疲劳综合征、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗死、中风、孤独症、癫痫、阿图斯现象、过敏反应，和酒精和药瘾。上面鉴定的自身免疫病症中，受影响的组织是主要靶标，在其它情况下，该组织是次要靶标。这些病症部分或主要是自身免疫综合征。因此，在治疗它们时，可以使用本文公开的相同方法，或者该相同方法的方面，有时与其他方法联合。
本发明的另一实施方案是根据本发明的抗-TNF-α多肽、或者编码所述多肽的核酸的用途，用于制备治疗与炎症过程有关的疾病的药物。疾病的实例包括类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。
通过常规途径，如静脉内途径可以对受试者施用根据本发明的多肽和核酸。然而，本发明的抗-TNF-α多肽的一个特别的性质是它们穿透诸如组织膜和/或肿瘤的屏障并且局部作用于它们，并且这些多肽足够稳定而可以抵抗诸如胃中的极端环境。因此，本发明的另一方面涉及抗-TNF-α多肽的递送。
根据本发明的受试者可以是易受治疗多肽的治疗影响的任何哺乳动物。
本发明的抗-TNF-α多肽的经口递送导致在结肠中受疾病影响的局部部位中提供活性形式的这种分子。这些部位可以高度发炎并且含有产生TNF-α的细胞。本发明的抗-TNF-α多肽结合TNF-α，可以局部中和TNF-α，避免了在全身的分布，从而限制了不利的副作用。遗传修饰的微生物如乳酸微球菌(Micrococcus lactis)可以分泌抗体或者其功能部分。这种修饰的微生物可用作载体以在肠内局部产生和递送抗体或者其功能部分。通过使用产生抗-TNF-α多肽的株系，可以治疗炎性肠综合征。
本发明的另一方面包括使用诸如WO00/23471中描述的载体通过非侵染性细菌，如革兰氏阳性宿主生物，如乳球菌属物种(Lactococcus spec.)的表面表达或者分泌递送抗-TNF多肽。
本发明的一个实施方案是如本文中公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻疾病的症状，这些疾病易受TNF-α调节物质的调节，该TNF-α调节物质能够穿过胃环境而不被失活。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。如本领域中技术人员公知的，一旦拥有所述多肽构建体，就可以应用配制技术在正确位置(胃中、结肠中，等等)释放大量多肽。该递送方法对于治疗、预防和/或减轻疾病的症状是重要的，其中这些疾病的靶标位于内脏系统中。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用如本文中公开的抗-TNF-α多肽，治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的另一个实施方案是如本文中公开的抗-TNF-α多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用如本文中公开的抗-TNF-α多肽向内脏系统递送TNF-α调节物质并且所述物质不被失活的方法。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用如本文中公开的抗-TNF-α多肽向受试者的血流递送TNF-α调节物质并且所述物质不被失活的方法。
本发明的另一个实施方案是如本文中公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。在非限制性实例中，根据本发明的制剂含有本文中公开的抗-TNF-α多肽，该制剂为凝胶、霜剂、栓剂、膜剂的形式或者为海绵或者阴道环的形式，该制剂随时间缓慢释放活性成分(这些制剂在EP 707473、EP 684814、US 5629001中描述)。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽经阴道和/或直肠施用于受试者以治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的方法，该TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的另一实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽经阴道和/或直肠道施用于受试者以将TNF-α调节物质递送到阴道和/或直肠道并且所述物质不被失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽经阴道和/或直肠道施用于受试者以将TNF-α调节物质递送所述受试者的血流并且所述物质不被失活的方法。
本发明的另一实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。在非限制性实例中，根据本发明的制剂含有本文中公开的抗-TNF-α多肽，该制剂为鼻喷雾剂(例如，气溶胶)或者吸入器的形式。因为该多肽构建体小，所以其可以比治疗性IgG分子更有效地到达其靶标。
本发明的一方面是通过嘴或鼻吸入将本文中公开的抗-TNF-α多肽施用于受试者以治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质被递送到上呼吸道和肺。
本发明的另一实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺，并且所述多肽未被失活。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽施用于受试者的鼻、上呼吸道和/或肺，将TNF-α调节物质递送到鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽施用于受试者的鼻、上呼吸道和/或肺，将TNF-α调节物质递送到受试者的血流而不失活的方法。
本发明的一个实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加肠粘膜的透性。文中公开的抗-TNF-α多肽因为它们的小尺寸，所以可以穿过肠粘膜并更有效地到达患有疾病的受试者的血流，所述疾病导致肠粘膜的透性增加，该疾病为例如，局限性回肠炎。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本文中公开的抗-TNF-α多肽治疗、预防和/或减轻疾病的症状的方法，所述疾病易受被递送到肠粘膜的TNF-α调节物质调节，其中所述疾病增加了肠粘膜的透性。
该方法甚至可以被本发明的额外方面——使用主动运输载体——进一步增强。在本发明的该方面，VHH与载体融合，该载体增强了穿过肠壁进入血流的传递。在非限制性实例中，该“载体”是另一VHH，其融合到治疗VHH。利用本领域中公知的方法制备这种融合构建体。该“载体”VHH特异结合到肠壁上的受体，该结合诱导穿过肠壁的主动传递。
本发明的另一实施方案是使用本文中公开的抗-TNF-α多肽制备用于治疗、预防和/或减轻疾病的症状的药物，该疾病易受递送到肠粘膜的TNF-α调节物质调节，其中所述疾病增加了肠粘膜的通透性。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本文中公开的抗-TNF-α多肽将TNF-α调节物质递送到肠粘膜而不失活的方法。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本发明的抗-TNF-α多肽将TNF-α调节物质递送到受试者的血流而不失活的方法。
该方法甚至可以被本发明的额外方面——使用主动运输载体——进一步增强。在本发明的该方面，本文中公开的抗-TNF-α多肽与载体融合，该载体增强了穿过肠壁进入血流的传递。在非限制性实例中，该“载体”是与所述多肽融合的VHH。利用本领域中公知的方法制备这种融合构建体。该“载体”VHH特异结合到肠壁上的受体，该结合诱导穿过肠壁的主动传递。
本发明的一个实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状，该TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。本文中公开的所述多肽构建体的制剂，例如，片剂、喷雾剂、滴剂被置于舌下并通过粘膜吸收到舌下的毛细管网络中。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽舌下施用于受试者，治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的方法，该TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质能够穿过舌下的组织。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽舌下施用于受试者将TNF-α调节物质递送到舌下的组织而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽经口施用于受试者而将TNF-α调节物质递送到受试者的血流而不失活的方法。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽在治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状中的应用，该TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。所述多肽构建体的制剂，例如，霜剂、膜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂被置于皮肤上并穿过皮肤。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽局部施用于受试者，治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的方法，该TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的抗-TNF-α多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，该TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽局部施用于受试者将TNF-α调节物质递送到皮肤而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗-TNF-α多肽局部施用于受试者而将TNF-α调节物质递送到受试者的血流的方法。
在本发明的另一方面，抗-TNF-α多肽还含有载体单结构域抗体(例如，VHH)，其作为主动运输载体将所述抗-TNF-α多肽从肺腔运输到血液中。
还含有载体的抗-TNF-α多肽特异结合粘膜表面(支气管上皮细胞)上的受体，导致该多肽从肺腔向血液的主动运输。该载体单结构域抗体可以融合到多肽构建体。这种融合构建体可以利用本领域中公知的方法制备并且在本文中描述。“载体”单结构域抗体特异结合粘膜表面上的受体，该结合诱导穿过该表面的主动传递。
本发明的另一方面是确定当经鼻施用时那些单结构域抗体(例如VHHs)被主动运输到血流中的方法。类似地，可以将首次用于实验的或者免疫VHH噬菌体文库经鼻施用，并且施用后不同的时间点后，可以分离血液或器官以拯救已经被主动运输到血流中的噬菌体。从肺腔向血流的主动运输的受体的一个非限制性实例是Fc受体N(FcRn)。本发明的一方面包括通过该方法鉴定的VHH分子。然后这种VHH可以作为载体VHH在经鼻施用时将治疗VHH递送到血流中的相应靶标中。
在本发明的一方面中，可以使用本文中公开的抗-TNF-α多肽，以便筛选调节该多肽与TNF-α结合的试剂。当在测量结合或者仅所述多肽置换的测定中鉴定时，试剂将必须进行功能试验以确定它们是否在体内调节抗原的作用。下面主要关于SEQ ID NO3给出了筛选测定的实例，然而本文中公开的任一种抗TNF-α多肽都是适宜的。
在置换实验的一个实例中，在渐增浓度的候选调节剂的存在或不存在时，将表达TNF-α或者其片段的噬菌体或者细胞与例如，SEQ ID NO3所代表的已经被标记的多肽在结合缓冲液中孵育。为了验证和校准该测定，可以实施对照竞争反应，该反应使用渐增浓度的所述多肽并且该多肽未被标记。孵育后，充分洗涤细胞，用对于给定标记适宜的方法(例如，闪烁计数、荧光，等)测量结合的标记多肽。候选调节剂存在下结合的所标记的多肽的量下降至少10％表明结合被候选调节剂置换。如果候选调节剂在1μM或更小的浓度下置换50％被标记的多肽(亚饱和多肽剂量)，那么认为该候选调节剂在本文中描述的该测定或者其他测定中特异结合。
备选地，通过表面胞质团共振(SPR)可以监视结合或者结合的置换。表面胞质团共振测定可用作定量方法以测量两个分子之间的结合，该测量是通过例如来自水相的SEQ ID NO3代表的多肽与传感器上膜中固定的TNF-α之间的结合或者结合的丧失导致该被固定的传感器附近质量的改变实现的。该质量的改变被测量为注射或除去所述多肽或者候选结合剂后相对于时间的共振单位并且使用Biacore生物传感器(Biacore AB)测量。根据Salamon等人(Salamon等人，1996，Biophys J.71283-294；Salamon等人，2001，Biophys.J.801557-1567；Salamon等人，1999，Trends Biochem.Sci.24213-219，每一篇都被并入本文作为参考。)描述的方法，可以将TNF-α例如固定在薄膜液体膜中的传感器芯片(例如，研究级CM5芯片，BiacoreAB)上。Sarrio等人阐明SPR可用于检测配体与固定在芯片上的液体层中的GPCR A(1)腺苷受体的结合(Sarrio等人，2000，Mol.Cell.Biol.205164-5174，被并入本文作为参考)。本领域技术人员使用Sarrio等人报导的条件作为起点可以微调SPR测定中SEQ ID NO3与TNF-α结合的条件。
SPR可以以至少两种方法测定结合调节剂。首先，SEQ ID NO3所代表的多肽例如，可以预先结合到被固定的TNF-α，然后注射浓度为0.1nM到1μM的候选调节剂。可以定量所结合的多肽的置换，从而可以检测调节剂结合。备选地，膜-结合的TNF-α可以与候选调节剂预孵育并用例如，SEQ ID NO3所代表的多肽刺激。所述多肽和与调节剂预孵育的TNF-α之间的结合亲合力与没有调节剂时所述多肽和TNF-α之间的结合相比的差异将表明在调节剂的存在下所述多肽的结合或置换。在任一测定中，相对于不存在候选调节剂时结合的所述多肽的量，存在候选调节剂时结合的所述多肽的量降低10％或以上表明该候选调节剂抑制TNF-α和所述多肽之间的相互作用。
检测例如SEQ ID NO3所代表的多肽与TNF-α之间的结合的抑制的另一种方法使用荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种量子力学现象，如果荧光供体(D)的发射光谱与荧光受体(A)的激发光谱重叠，在相互非常接近的荧光供体(D)和荧光受体(A)(通常相隔＜100)间发生FRET。所试验的分子，例如，SEQ ID NO3所代表的多肽和TNF-α被供体和受体荧光团的互补对标记。尽管被TNF-α多肽相互作用紧密结合，但是当所述多肽和TNF-α不结合时，供体荧光团的激发所发出的荧光将与应答该激发波长所发生的荧光具有不同的波长，从而通过测量每个波长下发射强度就可以定量结合的和未结合的分子。用于标记TNF-α的供体荧光团是本领域中熟知的。特别感兴趣的是A.Victoria GFP的变体，它们已知为Cyan FP(CFP，供体(D))和Yellow FP(YFP，受体(A))。作为实例，可以将YFP变体与TNF-α制成融合蛋白。用于表达GFP变体为融合物的载体(Clontech)以及荧光团标记的试剂(Molecular Probes)是本领域中公知的。将候选调节剂加入荧光-标记的多肽和YFP-TNF-α的混合物将导致能量转移的抑制，这可以通过例如，相对于没有候选调节剂的样品YFP荧光的降低来证明。在使用FRET检测TNF-α多肽相互作用的测定中，相对于没有候选调节剂的样品，含有候选调节剂的样品中受体波长下的荧光发射强度降低10％或更大，表明该候选调节剂抑制TNF-α多肽相互作用。
此处所用的样品可以是含有TNF-α的任一生物样品，诸如临床样品(例如，细胞级分、全血、血浆、血清、组织、细胞，等)、来自临床的样品、农业样品、法医样品、研究样品或者其他可能的样品。临床样品可来自人或动物来源。所分析的样品可以本质上是固体或液体。很明显当使用固体材料时，首先将它们溶于适宜的溶液中。
FRET的一种变通方案是使用荧光淬灭以监视分子相互作用。相互作用对中的一个分子可以被荧光团标记，另一个分子被一种分子标记，当该荧光团与该标记分子密切接合时淬灭该荧光团的荧光。激发时荧光的改变表明用荧光团淬灭剂配对所标记的分子的关联的变化。通常，被标记的TNF-α的荧光的增加表明具有淬灭剂的抗-TNF-α多肽已经被置换。对于淬灭测定，相对于没有候选调节剂的样品，含有该候选调节剂的样品中荧光发射强度增加10％或更大表明该候选调节剂抑制TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用。
除了表面胞质团共振和FRET方法，还使用荧光偏振测定定量结合。荧光标记的分子的荧光偏振值取决于转动相关时间(rotational correlationtime)或者翻转速度(tumbling rate)。复合物，诸如通过TNF-α与荧光标记的抗-TNF-α多肽结合形成的复合物比未复合的、标记多肽具有更高的偏振值。TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用的候选抑制剂的包含导致相对于没有候选抑制剂的混合物而言荧光偏振减小(如果候选抑制剂破坏或者抑制TNF-α与所述多肽的相互作用)。荧光偏振非常适于鉴定破坏TNF-α抗-TNF-α多肽复合物形成的小分子。相对于没有候选调节剂的样品中荧光偏振，含有候选调节剂的样品中荧光偏振减小10％或更多表明该候选调节剂抑制TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用。
监视TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用的另一备选方案使用生物传感器测定法。在本领域中已经描述的ICS生物传感器(Australian MembraneBiotechnology Research Institute；Cornell B，Braach-Maksvytis V，King L，Osman P，Raguse B，Wieczorek L，和Pace R.“A biosensor that usesion-channel switches”Nature 1997，387，580)。在该技术中，TNF-α和抗-TNF-α多肽的结合与悬浮的膜双层中gramacidin-推动的离子通道的关闭偶联并从而与生物传感器的导纳(admittance)(类似于impedence)的可测量的变化偶联。该方法在导纳变化的6个数量级内是线性的并且非常适于小分子组合文库的大规模、高通量筛选。相对于没有候选调节剂的样品的导纳，含有候选调节剂的样品中导纳的10％或更大的变化(增加或减小)表明候选调节剂抑制TNF-α和所述多肽的相互作用。重要的是注意到在检测TNF-α和抗-TNF-α多肽的相互作用的测定中，可能相互作用的调节剂不必一定直接与在生理上与所述多肽相互作用的蛋白质的结构域相互作用。还可能调节剂在从相互作用部位除去的位置相互作用并导致，例如，TNF-α中的构象变化。以该方式作用的调节剂(抑制剂或激动剂)仍然可以作为调节TNF-α与其受体结合的目标试剂。
所描述的任一种结合测定法都可用于确定样品(例如，组织样品)中试剂的存在，该试剂结合TNF-α或者影响例如，SEQ ID NO3所代表的多肽与TNF-α的结合。为此，在样品的存在或缺乏时，将TNF-α与所述多肽反应，并且用对所使用的结合测定适宜的方法测量多肽结合。所述多肽的结合减小10％或者以上表明该样品含有调节所述多肽与TNF-α结合的试剂。当然，上面的一般化方法可容易地应用于筛选候选调节剂，该候选调节剂改变本发明的任何抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分与TNF-α或者其片段之间的结合。
本发明的一个实施方案是通过文中公开的方法鉴定的未知试剂。
本发明的一个实施方案是通过文中公开的方法鉴定的未知试剂，该试剂用于治疗、预防和/或减轻与炎症过程有关的疾病的症状。
本发明的另一个实施方案是通过文中公开的方法鉴定的未知试剂的用途，用于治疗、预防和/或减轻与炎症过程有关的疾病的症状。
疾病的实例包括类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。
根据本发明使用的细胞优选选自细菌细胞如，例如，大肠杆菌、酵母细胞如，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤巴斯德酵母(P.pastors)、昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
根据本发明使用的细胞可以是任一细胞，依照本发明编码含有本发明的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的多肽的核酸序列可被导入该细胞，从而该多肽可以以如文中定义的天然水平或者高于天然水平表达。优选地，在细胞中表达的本发明的多肽显示出如文中定义的正常的或者接近正常的药理学。最优选地，在细胞中表达的本发明的多肽包括核苷酸序列，该核苷酸序列能够编码表1中给出的氨基酸序列的任一个或者能够编码与表1中给出的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。
根据本发明的优选实施方案，细胞选自COS7-细胞、CHO细胞、LM(TK-)细胞、NIH-3T3细胞、HEK-293细胞、K-562细胞或者1321N1星形细胞瘤细胞(astrocytoma cell)以及其他可被转染的细胞系。
通常，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指实现所希望的一个或多个结果(调节TNF-α结合；治疗或防止炎症)所需的量。本领域技术人员将认识到潜能和因此“有效量”将随着用于本发明中调节TNF-α结合的多种化合物而变。本领域技术人员将容易评估该化合物的潜能。
如文中所用的，术语“化合物”指本发明的抗-TNF-α多肽、组合物、或者能够编码所述多肽的核酸，或者根据文中描述的筛选方法鉴定的试剂或者含有一种或多种衍生氨基酸的所述多肽。
“药学上可接受的”指不是生物学上的材料或者不是不希望的材料，即，该材料可以与该化合物一起施用于个体而不导致任何不希望的生物学效应或不与药物组合物中所含有的其他组分的任一种以有害的方式相互作用。
如本文中公开的抗-TNF-α多肽用于治疗或者预防受试者中的病症并且包括施用药物有效量的化合物或组合物。
本发明的抗-TNF多肽用于治疗或预防受试者中与类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化有关的病症并且包括施用药物有效量的结合TNF-α的化合物或组合物。
本文中公开的抗-TNF-α多肽用于治疗或者预防受试者中的病症并且包括联合施用药物有效量的化合物与另一种化合物如，例如，阿司匹林。
本发明的抗-TNF多肽可用于治疗或预防受试者中与类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化有关的病症并且包括联合施用药物有效量的化合物与另一种化合物如，例如，阿司匹林。
本发明不限于施用含有本发明的单一化合物的制剂。在本发明范围内提供联合治疗，其中对需要该治疗的患者施用制剂，该制剂含有一种以上的本发明化合物。
TNF-α介导的病症包括，但不限于类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化。
用于本发明的化合物可配制成药物组合物并且以适于所选施用途径的各种形式施用于哺乳动物宿主，诸如人类患者或者家畜动物，该施用途径即经口或肠胃外、通过鼻内或者吸入、静脉内、肌内、局部或皮下途径。
利用递送的基因治疗方法也可以施用本发明的化合物。见，例如，美国专利号5,399,346，该专利被完整并入作为参考。使用递送的基因治疗方法，用本发明化合物的基因转染的原代细胞还可以另外被组织特异的启动子转染以靶定特定器官、组织、移植物、肿瘤，或者细胞。
因此，本发明化合物可以与药学上可接受的载体，诸如惰性稀释剂或者可同化的可食用载体组合全身施用，如经口施用。它们可以被封闭在硬或软壳明胶胶囊中，可被压缩成片剂，或者可以直接掺入患者膳食的食物中。对于经口治疗施用，活性化合物可以与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这种组合物和制剂将含有至少0.1％活性化合物。当然，组合物和制剂的百分数可以改变并且可便利地为给定单位剂型重量的约2到约60％。这种治疗上有用的组合物中活性化合物的量为将得到有效剂量水平的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等等还可以含有下面的结合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等等；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香剂如欧薄荷、冬青油，或者樱桃香料。当单位剂型是胶囊剂时，其除了上面类型的物质，还可以含有液态载体，如植物油或者聚乙二醇。可以存在多种其他材料组为包衣或者另外改变固态单位剂型的物理形式。例如，用明胶、蜡、虫胶或者糖等等可以将片剂、丸剂或者胶囊剂包衣。糖浆剂或者酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或者果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和香料如樱桃或者桔子香料。当然，用制备任一单位剂型中的任一材料都应该是药学上可接受的并且在用量内实质上无毒。此外，活性化合物可被掺入缓释制剂和装置。
还可以通过灌注或注射，静脉内或者腹膜内地施用活性化合物。可以在水中制备活性化合物或者其盐的溶液，其任选与无毒表面活性剂混合。还可以在甘油、液态聚乙二醇、三醋精，和它们的混合物和油中制备分散剂。在保存和使用的通常条件下，这些制剂含有用于防止微生物生长的防腐剂。
适于注射或灌注的药学剂型可包括含有活性成分的无菌水性溶液或者分散剂或者无菌粉剂，其适于临时制备无菌注射液或者灌注液或分散剂，任选封装在脂质体中。在所有情况中，最终剂型在生产和保存条件下必须是无菌的、液态和稳定的。
液态载体或赋形剂可以是溶剂或者液态分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇，等等)、植物油、无毒甘油酯，和它们的适宜的混合物。通过例如，形成脂质体，对于分散剂的情况，通过保持所需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂可以保持适当流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或者氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
将适当溶剂中的所需要的量的活性化合物与上面列举的多种其他成分(如果需要)合并，然后过滤除菌可以制备无菌注射液。对于用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况，优选制备方法是真空干燥和冰冻干燥技术，这些技术产生前面无菌过滤溶液中存在的活性成分加上额外的所希望的成分的粉末。
对于局部施用，本化合物可以以纯的形式应用(即，当它们是液体时)。然而，通常希望将它们作为组合物或者制剂，联合皮肤病学上可接受的载体施用于皮肤，这些载体可以是固体或者液体。
可用的固态载体包括细分的固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、硅土、矾土，等等。可用的液态载体包括水、羟烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇掺合物，其中本化合物可以任选通过无毒表面活性剂的帮助以有效水平溶解或者分散。可以加入佐剂诸如芳香剂或者抗微生物剂以优化给定用途的性质。所得液态组合物可以从吸收垫应用，用于浸渍绷带或者其他包扎用品，或者使用泵型或者气溶胶喷雾器喷到受侵袭的区域。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或者改性矿物材料可以与液态载体一起使用以形成可涂抹的膏剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂，等等，以直接应用于使用者的皮肤。
可用于将该化合物递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域中公知的；例如，见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等人(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
通过比较化合物的体外活性和动物模型中的体内活性可以确定该化合物的有用剂量。将小鼠，和其他动物中的有效剂量外推到人的方法是本领域中公知的；例如，见美国专利号4,938,949。
通常，液态组合物如洗剂中化合物的浓度将为约0.1-25wt-％，优选约0.5-10wt-％。半固态或者固态组合物如凝胶剂或者粉剂中的浓度将为约0.1-5wt-％，优选约0.5-2.5wt-％。
用于治疗所需的化合物，或者其活性盐或者衍生物的量将不仅随着所选的具体盐而且随着施用途径、被治疗的病症的性质和患者的年龄和状况而变，并且将最终由主治医生或者临床医生的判断决定。而且该化合物的剂量将根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物，或者器官而变。
所希望的剂量可便利地作为单剂给出或者作为分开的剂量给出，该分开的剂量以适宜的间隔施用，例如，作为每天2、3、4或多个亚剂量。该亚剂量本身还可以被分成例如，许多离散的松散隔开的施用；诸如吹入器的多次吸入或者通过应用于眼睛的多次滴剂。
施用方案可以包括长期的、每日治疗。“长期”指至少两周，优选数周、数月或者数年持续时间。本领域普通技术人员仅使用此处教导中的常规实验法就可以确定该剂量范围中必要的修饰。见Remington′s PharmaceuticalSciences(Martin，E.W.，第四版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。如果发生任何并发症，个别医生还可以调节剂量。
本发明提供了试剂，该试剂是TNF-α/TNF-α-受体相互作用的调节剂。
候选试剂可以是合成试剂，或者试剂的混合物，或者可以是天然产物(例如，植物提取物或者培养上清液)。根据本发明的候选试剂包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白质、糖类、脂质等。
可以从合成的或天然试剂的大文库中筛选候选调节剂。当前利用多种方法随机和定向合成糖、肽、和基于核酸的试剂。可以通过商业途径从许多公司得到合成试剂文库，这些公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)、和Microsource(New Milford，CT)。从Aldrich(Milwaukee，WI)可以得到稀有化学物文库。可以得到并且可以制备组合文库。备选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然试剂的文库可以从例如，Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到，或者通过本领域中熟知的方法容易地制备。此外，通过常规化学、物理和生物化学方法容易修饰天然的和合成产生的文库和试剂。
在多种化学品类别中可以发现有用的试剂。有用的试剂可以是有机试剂，或者小分子试剂。小分子试剂的分子量大于50但是小于约2,500道尔顿，优选小于约750，更优选小于约350道尔顿。代表性类别包括杂环类、肽、糖、类固醇，等等。可以修饰这些试剂以增强效能、稳定性、药物相容性，等等。试剂的结构鉴定可用于鉴定、产生或者筛选额外试剂。例如，当鉴定了肽试剂时，可将它们以各种方法修饰以增强它们的稳定性，诸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通过功能化氨基或者羧基末端，例如，对于氨基，酰化或者烷基化，对于羧基，酯化或者酰胺化，等等。
对于初步筛选，根据本发明的候选试剂的有用浓度为约10mM到约100μM或以上(即，1mM、10mM、100mM、1M等)。初步筛选浓度将用作上限，以及9种额外的浓度，其中通过将初步筛选浓度以半对数间隔(例如，对于9种额外的浓度)减小用于二次筛选或者用于产生浓度曲线来确定额外的浓度。
高通量筛选试剂盒根据本发明的高通量筛选试剂盒含有实施试剂的检测所有必要的方法和介质，该试剂在优选1μM到1mM浓度的多肽存在下通过与TNF-α相互作用调节TNF-α/TNF-α受体相互作用。
该试剂盒含有下面的本发明的重组细胞，其含有并表达编码TNF-α的核苷酸序列，根据本领域技术人员中公知的方法，特别是WO 00/02045中描述的方法，该重组细胞根据试剂盒生长在固体支持体，诸如微量滴定板，更优选地96孔微量滴定板上，备选地，本领域技术人员以纯化的形式提供TNF-α，其被固定在例如96孔微量滴定板上。备选地，在试剂盒中提供TNF-α，其被预先固定在例如，96孔微量滴定板上。TNF-α可以是完整TNF-α或者其片段。
浓度为约1μM到1mM或以上的根据本发明的调节剂被加到限定的孔中，孔中存在适当浓度的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分，所述多肽的所述浓度优选为1μM到1mM。试剂盒可以含有一种或多种抗-TNF-α多肽(例如，SEQ ID NOs1到15之一代表的一种或多种多肽或其他抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分)。
根据文中已经公开的方法实施结合测定并将结果与基线水平比较，基线水平为例如，不存在所加入的调节剂时TNF-α结合抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的水平。与不存在调节剂时活性水平相比，TNF-α-多肽结合(例如)增加或减少至少2倍、优选5倍，更优选10倍，最优选100倍或以上的孔被选择用于进一步分析。
根据本发明使用的其他试剂盒本发明提供了用于筛选TNF-α/TNF-α受体结合的调节剂的试剂盒，以及用于诊断特征为TNF-α机能障碍的疾病的试剂盒。本发明还提供了用于筛选疾病的调节剂的试剂盒以及它们的诊断试剂盒，所述疾病的特征是与TNF-α有关的一种或多种过程。根据本发明使用的试剂盒可包括分离的TNF-α。备选地，或者额外地，试剂盒可以含有被转化而表达TNF-α的细胞。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒可以含有编码TNF-α的多核苷酸。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒可以含有用于扩增TNF-α的特异引物。根据本发明使用的试剂盒可以含有分离的TNF-α多肽、其同源物，或者其功能部分。根据本发明的试剂盒可以含有被转化而表达所述多肽的细胞。试剂盒可以含有一种以上的多肽。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒可以含有编码TNF-α的多核苷酸。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒可以含有用于扩增大分子如，例如，TNF-α的特异引物。根据本发明的所有试剂盒将含有所陈述的物品或者物品的组合和包装材料。试剂盒将还包括使用说明书。
实施例通过下面的非限制性实施例阐明本发明。
实施例1针对人肿瘤坏死因子α的骆驼科抗体的实施例1)免疫和文库构建用人TNF-α免疫美洲驼(Llama glama)。为了免疫，用适宜的动物友好佐剂(Specoll，CEDI Diagnostics B.V.)将细胞因子配制成乳剂。通过颈部肌内双地点注射使用该抗原混合物。动物以每周的间隔接受6次乳剂注射，该乳剂含有100μg TNF-α。在免疫期间的不同时间点，从动物收集10ml血样并制备血清。使用血清样品在ELISA实验中用TNF验证抗原特异的体液免疫应答的诱导(数据未显示)。最后免疫后5天，收集150ml血样。从该样品分级分离(Lauwereys等人，1998)常规抗体和重链抗体(HcAbs)并用于ELISA中，ELISA揭示HcAbs负责抗原特异的体液免疫应答(数据未显示)。使用菲可帕克梯度(Amersham Biosciences)从150ml血样分离作为美洲驼重链免疫球蛋白(HcAbs)的遗传来源的外周血淋巴细胞(PBLs)，得到5×108个PBLs。预期抗体的最大多样性等于采样的B-淋巴细胞的数目，该数目为PBLs数目的约10％(5×107)。美洲驼中重链抗体的级分高达B淋巴细胞数目的20％。因此，150ml血样中HcAbs的最大多样性被计算为107种不同的分子。使用酸性硫氰酸胍提取(Chomczynski和Sacchi，1987)从这些细胞分离总RNA(约400μg)。
利用以前描述的(de Haard等人，1999)用M-MLV逆转录酶(GibcoBRL)和寡聚-dT-引物或者六核苷酸随机引物(Amersham Biosciences)从100μg总RNA制备cDNA。用苯酚/氯仿萃取联合乙醇沉淀纯化cDNA并将其随后用作模板以特异扩增VHH所有组成成分。
使用寡聚dT引发的cDNA作为模板用单简并框架1(FR1)引物ABL013(5′-GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG-3′)导入PstI限制位点(粗体)，联合EP01205100.9中描述的寡聚dT引物扩增VHH所有组成成分。该扩增产生了1650bp和1300bp的两个片段，后一片段是从CH1-缺失的HcAb基因得到的产物。较小的PCR产物被凝胶纯化并随后用PstI和BstEII消化。BstEII位点通常在重链来源的VHH编码DNA片段的FR4中存在。
备选地，用依赖铰链的方法使用两种IgG特异的寡核苷酸引物扩增VHH-所有组成成分。在一次PCR反应中，公知对HcAbs特异的短(5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′)或长(5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3′)铰链引物与FR1-引物ABL013(见上面)联合。PstI和NotI(粗体下划线)限制位点分别被导入FR1和铰链引物内以允许克隆。随后，将DNA片段连接到用PstI-BstEII或PstI-NotI消化的噬菌粒载体pAX004中，该载体与pHEN1(Hoogenboom等人，1991)相同但是编码分别用于纯化和检测的羧基末端(His)6-和c-myc-标签。连接混合物在Microcon滤器(YM-50，Millipore)脱盐并电穿孔到大肠杆菌TG1细胞以得到含有1.8×107个克隆的文库。被转化的细胞在装有含有100μg/ml氨苄西林和2％葡萄糖的LB的一个20×20cm盘上37℃下过夜生长。用2×TY培养基从盘子刮除菌落并在20％甘油中-80℃保存。
作为质量对照，通过PCR使用基于载体的引物的组合对每种文库的24个克隆验证含有插入片段的克隆的百分数。该分析揭示95％的克隆含有编码VHH的插入片段。通过这24个克隆的扩增的VHH片段的HinfI指纹分析检查变异性，从而表明所有克隆实际上是不同的(数据未显示)。
2)选择拮抗的抗-TNF VHH’s从两种文库制备噬菌体。为了挽救多克隆噬菌体所有组成成分，将文库在37℃下含有100μg/ml氨苄西林和2％葡萄糖的2×TY中生长到对数期(OD600＝0.5)，并随后用M13K07辅助噬菌体在37℃超感染30分钟。将被感染的细胞以4000rpm离心5分钟并重悬在含有100μg/ml氨苄西林和25μg/ml卡那霉素的2×TY中。通过在37℃和250rpm过夜生长增殖噬菌体。将过夜培养物以4500rpm离心15分钟并用1/5体积[20％聚乙二醇6000，1.5M NaCl]溶液在冰上孵育30分钟沉淀噬菌体。以4000×g在4℃离心15分钟沉淀噬菌体。噬菌体重悬在PBS中后，通过以在微量离心管中以最大速度(15000×g)离心1分钟沉淀细胞碎片。将含有噬菌体颗粒的上清液转移到新管中并如上描述的再次沉淀噬菌体。噬菌体溶于PBS中并且如上面提到的从剩余的细胞碎片分离。通过感染对数TG1细胞后在选择培养基上涂平板确定噬菌体的效价。
用体外生物素化TNF-α选择文库。如Magni等人(Anal Biochem2001，298，181-188)所描述的实施生物素化。通过SDS-PAGE分析和用Extravidin-碱性磷酸酶缀合物(Sigma)检测评估TNF中生物素的掺入。通过修饰蛋白结合固相包被的重组p75受体的能力来评价该修饰蛋白的功能性。
通过在链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(用100μl 10μg/ml链霉抗生物素蛋白，4℃包被16小时)上捕获生物素化TNF-α(室温下2小时，每孔10到400ng)选择VHH。通过用过量受体一细胞外配体结合结构域或者表达该受体的细胞洗脱得到拮抗的VHH。噬菌体与被捕获的细胞因子孵育2小时后，洗除非特异噬菌体，而将展示拮抗VHH的特定噬菌体用受体(CD120b或者p75的胞外结构域，10μM)或者用展示受体的细胞(＞105个KYM细胞/孔)洗脱。高富集，即用受体洗脱的噬菌体数目与用血清清蛋白(50μg/孔)洗脱的噬菌体数目的比例大于20表明成功地选择了TNF-α特异克隆。备选地，不是用受体洗脱，而是应用标准方法，其中低pH导致VHH和/或抗原的变性(0.1M甘氨酸缓冲液，pH2.5)。将对数期生长的大肠杆菌细胞用洗脱并被中和的噬菌体感染并铺在选择培养基上。挑选单个克隆并在微量滴定板上生长以在培养上清液中产生VHH。用捕获在Extravidin包被的平板上的TNF-α实施ELISA筛选揭示约50％阳性克隆。HinfI-指纹分析表明选择了13个不同的克隆，这些克隆以50ml规模被生长和诱导。所述克隆的序列在表1中显示。
更详细地表征了具有不同序列(图1)的5个克隆，它们的代号为VHH#1A、#2B、#3E、#3G、#7B和#12B。VHH#3E、#3G、和#7B是单结构域抗体片段，它们在FR2中的45位携带典型的亲水残基(精氨酸)并且在47位具有苯丙氨酸向色氨酸的置换，从而在溶解性方面赋予了有利特征。VHH#1A含有疏水FR2残基，其通常在人来源或者其他物种的双链抗体中发现，但是通过103位上的带电精氨酸残基弥补了亲水性的损失，该残基置换了来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基(PCT/EP02/07804)。本发明中描述的人源化骆驼科单结构域抗体的一个新的类别由VHH#2B和VHH#12B代表，其含有FR2中的疏水残基以及103位的疏水残基色氨酸。通过以50ml规模培养表达更大量的抗体片段并通过IMAC使用TALON树脂(Clontech)纯化。对PBS透析除去洗脱液咪唑后通过OD280确定VHH的量；从每个克隆得到约300μg VHH。该材料用于确定ELISA中(生物素化)TNF检测的灵敏性。为此，将链霉抗生物素蛋白(10μg/ml)包被的微量滴定板用于捕获生物素化TNF(1μg/ml)，将VHH在0.2％酪蛋白/PBS中稀释并在室温孵育2小时。用抗-MYC mAB9E10(0.5μg/ml)和抗小鼠AP缀合物(1000倍稀释，Sigma)检测结合的VHH。结果在图2中显示。
3)用KYM细胞系在细胞毒性测定中确定拮抗作用通过Vandenabeele和同事(Vandenabeele，P.，Declercq，W.，Vercammen，D.，Van de Craen，M.，Grooten，J.，Loetscher，H.，Brockhaus，M.，Lesslauer，W.，Fiers，W.(1992)Functional characterization of the human tumor necrosis factorreceptor p75 in a trasfected rat/moust T cell hybridoma.J.Exp.Med.176，1015-1024)描述的比色MTT测定法确定TNF-α诱导的白细胞郁积/细胞毒性。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)是一种灰黄色底物，其被活细胞切割而产生暗蓝色甲产物。该过程需要活性线粒体，甚至刚死亡的细胞也不能切割大量MTT。将KYM细胞(Sekiguchi M，ShirokoY，Suzuki T，Imada，Miyahara M，Fujii G.(1985)，Characterization of a humanrhabdomyosarcoma cell strain in tissue culture.Biomed.Pharmacother.39，372-380.)接种于96孔微量滴定板中并在TNF-α(0.216ng/ml或者约5pM三聚体)的存在或不存在下培养。除了TNF，培养期间还包括不同量的抗体(VHH或者英夫利昔单抗)。对于该测定，将MTT加入培养基，其终浓度为500μg/ml，将平板在37℃孵育以实现线粒体酶对MTT的切割。加入酸性异丙醇(40nM HCl溶于异丙醇中)或者DMSO溶解所形成的甲产物，该产物在孔的底部呈现黑色的、似绒毛的晶体。在570nm处测量吸收。
MTT测定(图3)表明VHH#1A(其在103位为精氨酸结合FR2中类似人的疏水残基)具有中等拮抗效果(IC50～100nM)。在FR2中具有特征型亲水残基的VHH#7B尽管在ELISA中灵敏检测细胞因子(曲线为显示)但是不能防止TNF-α与其配体的结合。相反，具有亲水FR2标志性残基的VHH#3E和#3G是非常强的拮抗性VHH’s(IC50为20nM)。VHH#3E和#3G具有高度同源性并且在克隆上相关(Harmsen等人，Mol.Immunol.37，579-590)，但是VHH#3E比VHH#3G更强(图2)，这可能是由于VHH#3E具有更高的亲合力。(嵌合的)单克隆抗体英夫利昔单抗非常有效(IC50为80pM)，但是其衍生的Fab片段丧失了该效能的大部分(IC50为3nM，为完整mAB的30分之一)。这清楚地表明抗体和细胞因子之间相互作用的亲合力效果具有两个结合位点的mAB通过协作结合更有效地与三聚体TNF分子相互作用。VHH片段是严格的单价，因此推测通过遗传融合VHH基因增加亲合力可以增加它们的拮抗效能(见实施例4)。
这些实验表明类似人的VHH的一个新的类别具有真实的结合和功能特征，从而使得它们可用于治疗目的。
实施例2通过定点诱变人源化VHH#12B和VHH#3E1)VHH#3E/VHH#12B和人种系重链V-区DP-47之间的同源性VHH#12B和人VH3种系序列(DP-47)的比对揭示了高度同源性●FR1中1、5、28和30位上4个氨基酸的改变●FR3中74、76、83、84和93位上5个氨基酸的改变●FR4中108位上1个氨基酸改变如在下面的序列比对中代表
DP-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYVHH#12B QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFEFENHWMYWVRQAPGKGLEWVSTVNTNGLITRYDP-47ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK -------------- -----------VHH#12BADSVKGRFTISRDNAKYTLYLQMNSLKSEDTAVYYCTKVLPPYSDDSRTNADWGQGTQVTVSS因此，与人种系基因DP-47具有高度同源性的TNF-α细胞因子的特异抑制剂是进一步人源化和评价ELISA中诱变对抑制能力的影响的理想候选者。
VHH#3E和人VH3种系(DP-47)的比对揭示与DP47中疏水残基相比VHH#3E的FR2中存在亲水氨基酸残基。
DP-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS-----WVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYVHH#3E QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYDP-47ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK --------------- -----------VHH#3EADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS通过人VH中存在的疏水残基评价取代亲水残基的效果是重要的，因为camelid VHH序列的大部分含有亲水残基。
2)VHH#12B的诱变通过Chen和Ruffner描述并且被Stratagene(Quickchange定点诱变)商业化的基于非-PCR的定点诱变方法突变VHH#12B。质粒DNA被用作模板，并使用2种诱变引物导入所希望的突变。这两种引物每一种都与模板质粒DNA的相反链互补。在使用PfuDNA聚合酶的聚合酶反应中，在使用有限数目的循环的循环程序期间，每条链从引物序列延伸。这导致野生型和突变链的混合物。用DpnI消化可以选择突变的体外合成的DNA链，因为仅模板链对于消化是敏感的。将DNA沉淀并转化到大肠杆菌中并通过序列分析分析所希望的突变。所产生的突变VHH’s和诱变引物在表2中列出。从突变克隆制备质粒并将其转化到WK6电感受态细胞。单个菌落被用于在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄西林的LB中过夜培养。该过夜培养物在含有100μg/ml氨苄西林的300ml TB培养基中稀释100倍，并在37℃孵育直到OD600nm＝2，当加入1mM IPTG和5mM MgSO4(终浓度)时并将培养物在37℃再孵育3小时。
将培养物在4℃以4,500rpm离心20分钟。沉淀过夜冰冻或者-20℃1小时。接着，在室温下解冻沉淀40分钟，将其重悬在20ml PBS/1mMEDTA/1M NaCl中并在冰上摇动1小时。通过在4℃以4,500rpm离心20分钟分离周质级分。将含有VHH的上清液装入TALON(ClonTech)并纯化到同质。用计算的消光系数确定VHH的产率。所表达的所有突变VHH’s与野生型相当。在体外受体结合测定中分析突变体的抑制能力。
用PBS中的2μg/ml依那西普(Wyeth)在4℃过夜包被微量滴定板。将该板用PBS-吐温洗涤5次并用含有1％酪蛋白的PBS在室温封闭1小时。用PBS-吐温洗涤微量滴定板5次。将生物素化人TNF-α(80μg/ml)与突变的或者野生型VHH#12B的稀释系列在室温下预孵育1小时并将混合物在室温下在微量滴定板的孔中孵育1小时。用PBS-吐温洗涤板5次。用Extravidin-AP(1/1,000稀释)和对硝基苯酚磷酸(pNPP)检测结合的人TNF-α。405nm 30分钟后测量信号。结果在图4和5中给出。IC50从66nM(野生型)到200nM(突变的Q1E+Q5L+A74S+Y76N+K83R+P84A)增加了3倍。位置T93A突变导致抑制丧失(数据未显示)。仍然需要人源化的位置是E28、E30和Q108。然而，E28和E30是H1正则结构的部分从而是根据Chothia编号系统的CDR1的部分。
突变VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs17到19中给出。
3)VHH#3E的诱变使用上面描述的基于非PCR的定点诱变方法突变VHH#3E。所得突变的VHH’s和诱变引物在表3中列出。
所有突变VHH的表达与野生型相当。在ELISA中分析纯化的突变VHH的结合并且在与上面描述的方法相同的受体结合测定中分析VHH的抑制能力。
ELISA的结果在图6中显示，受体结合测定的结果在图7中显示。
突变VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs 21到24给出。
实施例3针对小鼠TNF-α的拮抗VHH的分离1)选择抗小鼠TNF-αVHH为了在IBD或局限性回肠炎小鼠模型中实施效能研究，选择小鼠TNF特异的VHH。因此，如实施例1中描述的用小鼠TNF-α免疫美洲驼。从最后免疫后第4和10天采样的PBL以及第四天后从淋巴结的活组织检查提取RNA。将总RNA转化成随机引发的或者寡聚-dT引发的cDNA并用作VHH编码基因节段的扩增模板，该扩增使用Ig来源的引物或者寡聚-dT引物和单一Ig引物的混合物(见实施例1)。使用Ig引物从第一个PBL’s产生了含有8.5×107个克隆的文库的文库，从第二个PBL样品产生了7×106个克隆的文库，从淋巴结产生了5.8×108个克隆的文库。使用寡聚-dT引物和Ig引物的混合物从第一个PBL样品得到了含有1.2×108个克隆的文库，从第二个PBL样品得到了5.7×107个克隆的文库，并且淋巴结来源的文库含有2×108个克隆。根据所用的引物的组合合并文库并将所得两个文库培养以增殖噬菌体，如前面描述的。通过被捕获在包被的链霉抗生物素蛋白上的生物素化小鼠TNF-α实施选择，结合的噬菌体通过与人受体p75竞争而被洗脱，公知p75与小鼠TNF-α交叉反应。从用Ig衍生的引物扩增得到的文库选择两种不同的小鼠TNF-α特异VHH(VHH#m3F和VHH#m9E)，而从通过PCR用寡聚-dT引物和Ig-引物构建的文库得到两种密切相关的VHH(图8)。
2)用L929细胞系在细胞毒性测定中确定拮抗功效如实施例1中描述的应用相同类型的测定，但是使用鼠细胞系L929。证明VHH#m3F和VHH#m4B(图9)比另外两种VHH更有效10倍。
实施例4通过使用多价骆驼科抗体增加亲合力而增强拮抗功效1)针对人和小鼠TNF-α的二价、三价和四价VHH的拮抗功效设计了大肠杆菌生产载体pAX11(图10)，该载体允许两步克隆二价或双特异的VHH。首先用PstI和BstEII克隆羧基末端VHH，而在第二步中，通过SfiI和NotI插入另一VHH，SfiI和NotI不在第一个基因片段内切割。该方法避免了通过扩增产生新的位点从而避免了产生PCR错误的危险。
使用该载体产生了拮抗性抗-人TNF-αVHH#3E的二价衍生物。编码该二价VHH的质粒载体被用于产生三聚体和四聚体衍生物，这通过用BstEII部分消化该质粒完成，该消化在两个VHH基因片段中都发生。将线性化载体从凝胶纯化，随后去磷酸化并用作克隆约350bp的BstEII片段的受体，BstEII片段通过完全消化相同质粒得到。仅将BstEII片段连接后加入载体增强了多聚体VHH编码基因片段的插入。在大肠杆菌TG1中转化后，通过PCR，用M13Rev和M13Fwd引物筛选所得克隆；因为BstEII是不对成切割酶(5nt突出端)，所以仅得到正确方向的插入片段，这通过仅用PstI消化(350bp)或者用EcoRI和HindIII双消化(对于二价(BIV 3E，SEQ ID NO73)得到1000bp，对于三价(TRI 3E，SEQ ID NO74)得到1350bp，对于四价(TETRA 3E，SEQ ID NO75)得到1700bp)，数据未显示)质粒来证实。序列在表7中列出。
以50ml规模生长和诱导克隆，制备周质级分并用于使用TALON树脂实施的IMAC纯化。用考马斯染色的PAGE分析纯化产物揭示了完整多价VHH的良好的生产水平(每升细胞培养物2到10mg)(见图11)。通过Superdex 75HR柱上凝胶过滤确定IMAC纯化的VHH的分子外观并且如所预期的，具有更高亲合力的分子更早地从柱子出来(见图12)。
用基于细胞的测定法使用KYM细胞分析拮抗功效。细胞被接种于微量滴定板中并在TNF-α(1.29ng/ml或者约25pM三聚体)存在或不存在时培养。该测定(图13)揭示用于该研究中的单价分子具有最弱的拮抗特征。通过它们的IC50值所反映的来自嵌合抗体英夫利昔单抗的Fab的IC50为2nM，对于VHH#3E，IC50为12nM(也见图3)。所用分子的亲合力对拮抗功效具有显著的影响，这通过使用二价IgG分子英夫利昔单抗观察到，该分子比Fab的有效性强40倍(IC5050pM)。TNF-α是三聚体分子，其与二聚体受体相互作用并且因此可以预期IgG的亲合力允许与该细胞因子上的两个表位相互结合并形成在前描述的(Santora等人，Anal.Biochem.299，119-129)大复合物。令人惊奇地，VHH从单体向二聚体的亲合力的增加比用英夫利昔单抗所观察到的具有大得多的显著效果，因为二聚体的IC50(30pM)比单体的低400倍。增加亲合力甚至更导致更好的拮抗行为三聚体VHH的IC50为20pM，四价形式为6pM。VHH的所有更高亲合力形式都比英夫利昔单抗更有效，而四价形式比依那西普更强，其中依那西普由受体p75的胞外结构域与IgG的Fc融合组成，因此其是二价结合模式。
用针对小鼠TNF产生的VHH观察到亲合力对拮抗行为的同样出乎意料的影响(图14)。用MTT作为底物和小鼠TNF-α(65pg/ml或者1.3pM)实施相同类型的细胞毒性测定，但是使用鼠细胞系L929，该细胞系表达小鼠特异受体。鉴定了三种不同的拮抗(单价)VHH，它们的代码为9E和3F，其中前两种的IC50为25nM，后一种的IC50为2nM(也见实施例3)。3F转化成二价形式(BIV#m3F，SEQ ID NO76)导致IC50增加1000倍(2pM)，从而再一次表明该抗体的增加的亲合力导致拮抗特征的出乎意料的改善。
2)与VHH-Fc融合的比较VHH#3E针对人TNF，通过PstI和BstEII将VHH#3E克隆到来自pCDNA3的改良载体，从而产生与人IgG1的CH1缺失的Fc部分的遗传融合。通过测序证实后，将该质粒构建体转染到骨髓瘤细胞系NS0中。培养所得细胞系并且VHH-Fc融合体被分泌到培养上清液中。用抗-人FcVHH树脂纯化产物并在考马斯染色的凝胶上分析(图15)。在DTT存在下，观察到融合体为45kDa蛋白，不存在DTT时，可以观察到二价分子的分子量为90kDa。该二价产物由两条链通过两个二硫键连接产生，这两个二硫键来自位于铰链区中的半胱氨酸残基。在生物测定中使用人细胞系KYM试验了VHH融合体并且结果比二价VHH功效少5倍，尽管这两种分子具有相同的亲合力并且它们都来自VHH#3E(图16)。可能是大体积的Fc尾的空间位阻导致该差异。
实施例5计算本发明的抗-靶标-单结构域抗体间的同源性使用Bioedit Sequence Alignment Editor计算本发明的抗-靶标单结构域抗体之间的氨基酸序列同源性程度。通过ClustalW.(Thompson，J.D.，Higgins，D.G和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W通过序列加权、位置特异的缺口罚分和权重矩阵选择提高渐进性多序列比对的灵敏度.NucleicAcids Research，1994年6月提交)比对序列，计算所有序列之间的相同残基的比例。表8指出了本发明的抗-血清清蛋白VHHs之间的部分同源性。表9指出了本发明的抗-TNF-αVHH间的部分同源性。表10指出了本发明的抗-IFN-γVHH间的百分数同源性。
实施例6VHH#3E的VHH-CDR3片段的表达使用位于框架4区(正向CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG)中的正义引物和位于框架3区(反向TGTGCAGCAAGAGACGG)的反义引物扩增VHH#3E的CDR3区域。为了克隆pAX10中的CDR-3片段，用下面的引物实施第二轮PCR扩增，导入所需的限制位点反向引物Sfi1GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG正向引物Not1GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG在50ml反应体积中使用50pmol每种引物实施PCR反应。初次PCR的反应条件为94℃11分钟，然后30个循环的94/55/72℃下30/60/120秒，和72℃5分钟。用2.5mM MgCl2，200mM dNTP和1.25U AmpliTaq GodDNA聚合酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)实施所有反应。
用Sfi1和Not1切割后将PCR产物克隆到pAX10。
实施例7对人TNFα特异的抗体片段的稳定性试验经口施用的蛋白质受到胃中酸性pH的变性以及胃蛋白酶的分解。我们已选择了研究VHH#3E对胃蛋白酶的抗性研究条件，假定这些条件模拟胃环境。在大肠杆菌中作为重组蛋白产生了对人TNFα特异一种VHHVHH#3E，将该蛋白通过IMAC和凝胶过滤层析纯化至同质。用280nm处的计算的摩尔消光系数通过分光光度法确定纯化后的蛋白质浓度。在分别为pH2、pH3和4的McIIvaine缓冲液(J.Biol.Chem.49，1921，183)中制备100微克/ml的稀释液。然后将这些溶液在37℃孵育15分钟，之后以1/30w/w比例加入猪胃粘膜胃蛋白。加入该蛋白酶60分钟后，收集样品并立即在含有0.1％酪蛋白的pH7.4的PBS中稀释100倍使胃蛋白酶失活。从该样品制备7份额外的3倍稀释液以通过ELISA评估功能抗体片段的存在。从收集的等分试样制备相同稀释液，之后加入该蛋白酶作为参比。在ELISA测定中，在包被neutravidin的微量滴定板的孔中捕获生物素化TNFα。对于胃蛋白酶处理的样品和参比样品，制备样品的类似的连续稀释液并向孔中加入100微升那些稀释液。孵育1小时后洗涤微量滴定板。为了检测VHH与被捕获的TNFα的结合，使用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)和抗兔IgG碱性磷酸酶缀合物。洗涤后，用对硝基苯酚磷酸使板显色。在图17中绘制的数据对暴露于消化条件的所有样品以及参比样品显示出相似的曲线。这表明VHH#3E在所有选择的条件下基本上保留其功能活性。
实施例8小鼠中抗-人TNFα特异VHH的经口施用制备含有抗-人TNFα特异的VHH#3E(100微克/微升，在PBS中稀释100倍)的抗体溶液。三只小鼠首先被12小时不许引水，然后在后两个小时内允许自由接近抗体溶液。之后，处死小鼠并解剖它们的胃。立即通过含有1％BSA的500微升PBS冲洗胃以得到胃的内容物。该冲洗的物质被随后用于制备连续三倍稀释液，以未稀释的物质的1/5稀释开始。将100微升这些样品转移到用人TNFα包被的微量滴定板的各个孔中。孵育1小时并充分洗涤后，用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)接着用抗兔碱性磷酸酶缀合物孵育来评估免疫活性物质的存在。用对硝基苯基乙酸使ELISA显色。10分钟后所得ELISA信号清楚地表明在这些小鼠的胃冲洗物中存在功能性VHH#3E。通过与标准曲线比较，我们确定对于所试验的三只小鼠，胃冲洗液中功能性抗体片段的浓度分别为1.5、12.6和8.6微克/ml。
实施例9IBD动物模型中的效能1)慢性结肠炎的动物模型在DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导BALB/c小鼠中慢性结肠炎模型中评估通过各种施用途径应用的二价VHH构建体的效能。该模型最初由Okayasu等人[Okayasu等人Gastroenterology 1990；98694-702]中描述并由Kojouharoff等人[G.Kojouharoff等人Clin.Exp.Immunol.1997；107353-8]改进。动物从德国的Charles River Laboratories得到，11周龄，并且保持在动物设施中直到它们的体重达到21到22g。通过四个DSS处理周期在动物中诱导慢性结肠炎。每个周期由DSS处理间隔(7天)组成，其中在饮用水中提供浓度为5％(w/v)的DSS，在恢复间隔(12天)中的饮用水中不存在DSS。最后的恢复周期从12天延长到21天以提供炎症状态，在治疗时该炎症状态代表慢性而不是急性炎症。最后恢复间隔之后，小鼠被随机分配到8只小鼠的组中并开始用VHH-构建体治疗。治疗间隔为2周。治疗间隔后一周处死动物，将肠解剖并实施组织学检查。实验设置在图18中示意性地显示。
2)VHH治疗方案在VHH治疗期间，通过胃内或者静脉内应用100μg二价VHH3F对小鼠(每组8只)用二价VHH#3F(VHH#m3F-VHH#m3F；SEQ ID No.76)每天治疗，连续治疗14天。用二价VHH#3F直肠地每隔一天治疗额外的动物组，持续治疗14天。在所有治疗组中，以缓冲液中的1mg/ml浓度应用二价VHH#3F的100μg剂量。阴性对照组在另外相同条件下接受100μl PBS。治疗方案在表11中显示。
3)结果处死小鼠后，确定体重并解剖结肠。确定解剖的结肠长度并通过苏木精-伊红(HE)染色(标准条件)评估结肠的组织学。与阴性对照(PBS处理)相比，用二价nanobody 3F治疗的组显示出更长的(prorogued)结肠长度以及更高的组织学得分[G.Kojouharoff等人，Clin.Exp.Immunol.1997；107353-8]，从而表明治疗的功效。
表1针对TNF-α的本发明各方面肽的氨基酸序列表
表2用于VHH#12B的诱变的诱变反应、诱变引物和模板的列表
表3用于VHH#3E的诱变的诱变反应、诱变引物和模板列表
表4人源化和野生型抗TNF-αVHH的概况
表5抗小鼠血清清蛋白，和抗小鼠血清清蛋白+抗TNF-αVHH
表6针对人IFN-γ的VHH的氨基酸序列表
表7针对TNF-α的二价(BIV 3E，BIV#m3F)、三价(TRI3E)或四价(TETRA 3E)VHH的序列
表8本发明的抗小鼠血清清蛋白VHH的氨基酸序列间的部分同源性
表9本发明的抗TNF-αVHH间的部分同源性
表10本发明的抗IFN-γVHH间的百分比同源性
表11治疗程序表
权利要求
1.抗-TNF-α多肽，其含有至少一个抗-TNF-α单结构域抗体。
2.根据权利要求1的抗-TNF-α多肽，其中单结构域抗体相应于SEQ IDNOs1到16和79到84之一代表的序列。
3.根据权利要求1和2的抗-TNF-α多肽，其还含有针对血清蛋白的至少一个单结构域抗体。
4.根据权利要求1到3任一项的抗-TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、运铁蛋白，或者血纤蛋白原的任何一种。
5.根据权利要求3和4的抗-TNF-α多肽，其中单结构域抗血清蛋白单结构域抗体相应于SEQ ID NOs26到29和85到97任一个代表的序列。
6.根据权利要求3到5任一项的抗-TNF-α多肽，其相应于SEQ ID NOs30到43任一个代表的序列。
7.根据权利要求1到6任一项的抗-TNF-α多肽，其还含有至少一种单结构域抗体，所述单结构域抗体选自由抗-IFN-γ单结构域抗体、抗-TNF-α受体单结构域抗体和抗-IFN-γ受体单结构域抗体组成的组。
8.根据权利要求1到7任一项的抗-TNF-α多肽，其中针对TNF-α的单结构域抗体的数目至少为2。
9.根据权利要求8的抗-TNF-α多肽，其相应于SEQ ID NOs73到76任一个代表的序列。
10.根据权利要求1到9任一项的抗-TNF-α多肽，其中至少一种单结构域抗体是人源化的骆驼科VHH。
11.根据权利要求10的抗-TNF-α多肽，其中人源化的骆驼科VHH相应于SEQ ID NOs17到19和21到24任一个代表的序列。
12.一种组合物，其含有根据权利要求1到11任一项的抗-TNF-α多肽和至少一种单结构域抗体，所述单结构域抗体选自由抗-IFN-γ单结构域抗体、抗-TNF-α受体单结构域抗体和抗-IFN-γ受体单结构域抗体组成的组，用于同时、分开或者顺序地施用于受试者。
13.根据权利要求7到11任一项的抗-TNF-α多肽，或者根据权利要求12的组合物，其中至少一种抗-IFN-γ单结构域抗体相应于SEQ ID NOs44到72任一个代表的序列。
14.根据权利要求1到11和13任一项的抗-TNF-α多肽，或者根据权利要求12和13的组合物，其中所述单结构域抗体是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分，或者同源序列的功能部分。
15.根据权利要求1到11和13和14任一项的抗-TNF-α多肽，或者根据权利要求12到14的组合物，其中抗-TNF-α多肽是全长抗-TNF-α多肽的同源序列、功能部分，或者同源序列的功能部分。
16.根据权利要求1到11和13和15任一项的抗-TNF-α多肽，或者根据权利要求12到15的组合物，其中至少一种单结构域抗体是骆驼科VHH。
17.核酸，其编码根据权利要求1到16任一项的抗-TNF-α多肽。
18.一种鉴定试剂的方法，所述试剂调节权利要求1到11和13到16任一项的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合，该方法包括步骤(a)在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下，将权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合的降低将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节权利要求1到11和13到16任一项的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合。
19.一种通过权利要求1到11和13到16任一项的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合鉴定试剂的方法，所述试剂调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病，该方法包括(a)在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下，将权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合的降低将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病。
20.一种通过权利要求1到11和13到16任一项的抗-TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合鉴定试剂的方法，所述试剂调节肿瘤坏死因子-α与其受体的结合，该方法包括(a)在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下，将权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽与靶标肿瘤坏死因子-α接触，和(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合的降低将所述候选调节剂鉴定为一种试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α与其受体的结合。
21.一种筛选调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病的试剂的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α。
22.根据权利要求18的方法鉴定的未知试剂，该试剂调节权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽与肿瘤坏死因子-α的结合。
23.根据权利要求19和20的方法鉴定的未知试剂，该试剂调节肿瘤坏死因子-α介导的疾病。
24.根据权利要求23的未知试剂，其中所述疾病是炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化的一种和多种。
25.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求17的核酸，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，或者根据权利要求22到24任一项的试剂，用于治疗和/或预防和/或减轻与炎症过程有关的疾病。
26.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求17的核酸，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，或者根据权利要求20到21任一项的试剂的用途，用于制备治疗和/或预防和/或减轻与炎症反应有关的疾病的药物。
27.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质能够穿过胃环境而该物质不被失活。
28.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质能够穿过胃环境而该物质不被失活。
29.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
30.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质被递送到阴道和/或直肠道。
31.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
32.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
33.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜的通透性。
34.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜的通透性。
35.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
36.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质能够有效穿过舌下的组织。
37.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，用于治疗和/或预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病，所述TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
38.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受TNF-α调节物质调节的疾病的症状的药物，所述TNF-α调节物质能够有效穿过皮肤。
39.根据权利要求19的方法、根据权利要求21的试剂盒、根据权利要求25的核酸或者试剂，根据权利要求26的核酸或者试剂的用途，根据权利要求25、27、29、31、33、35、37和39任一项的组合物，根据权利要求26、28、30、32、34、36、和38任一项的组合物的用途，权利要求25、27、29、31、33、35、37和39任一项的抗TNF-α多肽、根据权利要求26、28、30、32、34、36、和38任一项的抗TNF-α多肽的用途，其中所述疾病是炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、多发性硬化、阿狄森氏病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、肾小球性肾炎、突眼性甲状腺肿、急性热病性多神经炎、淋巴瘤性甲状腺肿、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、斯耶格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎，和脉管炎的任一种。
40.一种组合物，其含有根据权利要求25的核酸或者试剂、权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽，或者根据权利要求12到16任一项的组合物，和适宜的药物载体。
41.一种诊断特征为肿瘤坏死因子-α机能障碍的疾病的方法，该方法包括(a)将样品与权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽接触，(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和(c)将步骤(b)中所检测到的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合中的差异诊断特征为肿瘤坏死因子-α的机能障碍的疾病。
42.一种试剂盒，其使用根据权利要求38的方法筛选权利要求39中引用的疾病。
43.一种筛选权利要求39中引用的疾病的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1到11和13到16任一项的分离的抗TNF-α多肽。
44.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽的用途，用于纯化所述肿瘤坏死因子-α。
45.权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽的用途，用于抑制肿瘤坏死因子-α和一种或多种肿瘤坏死因子-α受体之间的相互作用。
46.一种产生权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽的方法，该方法包括步骤(a)得到编码针对肿瘤坏死因子-α的骆驼科VHH的双链DNA，(b)克隆和表达步骤(b)中所选的DNA。
47.一种产生权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽的方法，该方法包括(a)在允许表达所述多肽的条件下，培养含有能够编码权利要求1到11和13到16任一项的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主细胞，和(b)从培养物回收所产生的多肽。
48.根据权利要求47的方法，其中所述宿主细胞是细菌或酵母。
49.一种用于筛选炎症、类风湿性关节炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎性肠综合征和多发性硬化任一种的试剂盒，其含有权利要求1到11和13到16任一项的抗TNF-α多肽。
全文摘要
本发明涉及从针对肿瘤坏死因子－α的单结构域重链抗体衍生的多肽。本发明还涉及单结构域抗体，这些抗体为骆驼科VHHs。还涉及施用所述多肽的方法。还涉及筛选调节TNF－α受体的试剂的方案，和从所述筛选得到的试剂。
文档编号A61P37/06GK1735629SQ200380108511
公开日2006年2月15日 申请日期2003年11月7日 优先权日2002年11月8日
发明者卡伦·西莱恩克, 马克·劳韦里斯, 汉斯·德哈德 申请人:埃博灵克斯股份有限公司