针对人IgG抗体的CH1结构域中表位的抗原结合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用抗原结合蛋白纯化包含人IgG-CH1结构域的分子的方法，所述抗原结合蛋白能结合包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中的表位。本发明进一步涉及能用于本发明方法中的抗原结合蛋白。本发明的抗原结合蛋白的构架区优选相应于天然没有轻链的抗体的那些构架区，例如可以在骆驼中发现的抗体。本发明进一步涉及编码这种抗原结合蛋白的核酸，包含这种蛋白的免疫吸附材料，及这种免疫吸附材料从各种物质中纯化含有IgG-CH1结构域的分子的用途。
【专利说明】针对人IgG抗体的CH1结构域中表位的抗原结合蛋白
发明领域
[0001] 本发明涉及生物化学及免疫学领域，特别是免疫亲和性及抗体技术。本发明涉及用能结合人CHl结 构域的抗原结合蛋白捕获包含人IgG-CHl结构域的靶分子的方法。本发明进一步涉及用于所述方法中的手段，包括衍生自骆驼(camelid)抗体的抗原结合蛋白，包含这种蛋白的免疫吸附材料及其生产手段和方法。
_2] 发明背景
[0003]哺乳动物IgG抗体和/或其Fab片段、特别是人和/或人源化IgG抗体和/或其Fab片段的高效、快速、节约和成本高效的纯化是现有技术中深入研究的问题。随着新的基于抗体药物的出现，IgG和/或其Fab片段的纯化在基于抗体药物生产中变成更关键和昂贵的步骤，需要高纯度。另外，这种治疗性抗体必须保持它们的结合亲和性及生物学活性，包括效应物功能。
[0004]为了纯化所有4个亚类的人或人源化IgG，即人/人源化IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，常用纯化方法包括使用经典生化分离和纯化技术如阴离子/阳离子交换、大小排阻/凝胶过滤、沉淀及应用特异性亲和性配体。常用亲和性配体是细菌衍生的蛋白A和蛋白G，单克隆抗体及骆驼抗体或者衍生自其中的结合片段，其结合4个亚类人或人源化IgG的一或多个亚类。
[0005]蛋白A结合人IgGl、人IgG2和人IgG4(Fc)的CH2-CH3界面，因此不能用于纯化人IgG3，因此不能用于所有人IgG亚类。蛋白A显示与VH3家族的一些人VH结构域结合，但是不与人 VHl 和 VH2 结合(Janssonet al (1998) FEMS Immunology and MedicalMicrobiology20:69-78)，因此蛋白A不能用作通用工具纯化所有人IgG衍生的Fab片段。另外，蛋白A不能用于从由人IgG Fe-和Fab片段的混合物组成的原料样品中选择性捕获人IgG衍生的Fab片段，因为其对IgG Fe结构域的结合反应性更突出。另外，基于Z结构域的蛋白A变体(如MabSelect Sure)缺少结合人VH3结构域的能力，因此不能用于Fab纯化。
[0006]蛋白G是由C和G群链球菌表达的细菌表面蛋白。蛋白G以高亲和性识别在人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗体的Fe部分(Fe Y )上CH2和CH3结构域之间界面处的共同位点。另外，蛋白G显示通过结合IgG的CHl结构域组合kappa同种型的CL结构域而结合IgG 抗体的 Fab 部分(Derrick and Wigley (1994) J.Mol.Biol.243:906-918)。蛋白 G 仅结合来自 IgGl、IgG3 和 IgG4 的 Fab,但是不结合 IgG2 的 Fab (Perosa et al (1997) Journalof Immunological Methods203:153-155)。对CHl的结合亲和性显著低于Fe部分上的其表位，这例如反映在必须使用低流速以使得有效纯化人Fab片段(Proudfoot et al.(1992)Protein expression and purifications:368-373) ? 关于蛋白 G 在 CH2 和 CH3 结构域界面的结合，实验数据表明发生诱导契合，其可以解释洗脱所需的严苛条件，如在等于或低于ρΗ2.5 的洗脱 pH所不(PROTEUS, Protein G Antibody Purification Handbook ；Mini&Midispincolumns ；5September2005 ;Pro_Chem, Littleton, USA)。这些严苛条件可影响结合位点的构象，由此改变纯化的IgG抗体的免疫功能(P.Gagnon, 1996, in Purification toolsfor monoclonal antibodies,published by Validated Biosystems,Inc5800N)。X-身寸线晶体测量示出通过结合蛋白A，CH2结构域可以朝CH3结构域纵向移位，其最终导致CH2结构域之间碳水化合物区域的部分旋转及去稳定化。所述变形干扰随后的蛋白质-蛋白质相互作用，这种相互作用是IgG发挥其效应物功能所需的。除了严苛洗脱条件对抗原结合能力的后果(特别是对于蛋白G)，这些二级作用有时干扰或改变抗体效应物功能及增加免疫球蛋白对蛋白酶解的易感性。如果人或人源化抗体用作治疗目的，由变性导致的效应物功能的丧失改变折叠及纯化步骤期间产生的化学修饰是非常不希望的。特别地，分子内及分子间硫桥的还原经常是纯化和储存期间产生的问题。
[0007]蛋白L经VL kappal、3和4结合人Fab,但是不结合VL kappa2及不结合lambda同种型的任何VL结构域。因此，蛋白L不结合全部人IgG衍生的Fab片段并且不是仅对IgG选择性的。
[0008]作为人IgG结合蛋白如蛋白G的替代，在文献中已描述一些小鼠单克隆抗体(Mab)能够结合人 IgG 抗体的 Fe 结构域(Nelson PN, et al.Characterisation ofant1-1gG monoclonal antibody A57H by epitope mapping.Biochem Soc Transl997 ；25:373)。已鉴别一些共同Fe表位，例如:Mab G7C、JD312具有在CH2上的结合表位，氨基酸 290-KPREE-294。Mab PNF69C、PNFl IOA、PNF211C 具有在 CH2-CH3 上的结合表位，AA:338-KAKGQPR-344。Mab A57H 显示在 CH3 上的结合表位，AA380-EWESNGQPE-388。与使用小鼠Mab或者来自其它非人物种的Mab相关的问题是Mab从基质释放导致纯化的制备物中的污染很难被除去。另外，Mab及其功能片段(Fab、Fab2)容易变性，对于分子的正确3D结构及重链和轻链排列所需的S-S桥容易被破坏，特别是在经常是释放柱结合人IgG所需的严苛洗脱条件下。由于基于Mab的亲 和性配体的弱点，柱容量快速降低，柱在洗脱后的再利用能力非常有限并且不适合连续操作。
[0009]代替EP-A-434317所述的(sc) Fv片段，如W02006 / 059904所述的衍生自天然缺乏轻链的抗体的抗体片段(VHH)也可以用于产生免疫吸附材料用于人IgG抗体的纯化。应用这些VHH片段的优势是它们是单结构域肽，甚至在更高温度下也非常稳定。另外，VHH小，容易在节约成本的宿主生物体如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产。另外，由于这些VHH片段与人VH3结构域家族之间的序列相似性，预期与细菌表面蛋白如蛋白A和G相比免疫原性非常低。这些抗体在EP-A-656946中更详细描述。
[0010]W02006 / 059904所述的氨基酸序列涉及结合kappa或lambda同种型的人抗体轻链的VHH片段，因此不能选择性纯化仅IgG同种型的抗体和/或Fab片段。另外，在例如表达人IgG抗体和/或其Fab片段的细胞系的上清中存在的过量轻链也会被所述配体捕获。合成配体如 Fabsorbent? FlP HF(ProMetic BioSciences Ltd, Cambridge, UK)具有相同缺点。
[0011]W02009 / 011572所述的氨基酸序列涉及结合人IgG的Fe部分的VHH片段。因此它们不能纯化不包含Fe结构域的人IgG的片段，如人IgG的F(ab’)2片段的Fab。
[0012]Carredano et al.描述了用于人Fab纯化的合成亲和性配体的开发,它们结合所有IgG-kappa类型抗体共有的保守腔(在IgG CHl和CL-kappa结构域之间形成的小袋)(Carredano et al.(2004)Protein Sciencel3:1476-1488)。尽管 IgG-CHl 被认为是在不同IgG Fab片段之间最保守的区域,但是Carredano et al.的结论是这个结构域对于产生好的结合亲和性配体是不太合适的，因为其扁平结构(也在Derrick et al.如前中报道)。相反，选择上述腔，因此没有对包含lambda同种型轻链的人Fab片段的反应性。
[0013]因此，现有技术中已知的结合剂已被描述可以用于纯化人IgG抗体和/或其Fab片段。但是这些结合剂(本身)无一能提供通用纯化方法用于所有人IgG抗体和/或其Fab片段。因此，现有技术需要新的手段和方法以获得捕获和/或纯化人或人源化IgGl、IgG2、IgG3和IgG4和/或其Fab片段的通用方法。
[0014]发明概沭
[0015]在第一方面，本发明涉及用于捕获包含人IgG-CHl结构域的靶分子的方法，其中所述方法包括步骤:a)将包含靶分子的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及《使得靶分子通过特异性结合抗原结合蛋白而被免疫吸附材料捕获；其中所述抗原结合蛋白能够结合单表位，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CHl结构域中，其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH交叉阻断(cross-blocked)或者其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ IDNO:1-158任一氨基酸序列的VHH交叉阻断，优选其中所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域包含针对所述表位的完整抗原结合位点。
[0016]在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白包含:a)可得自骆驼或鲨鱼的抗体，所述抗体仅由重链组成并且天然缺少轻链；b)在a)中限定的抗体的可变结构域；或者c)可变结构域，其中在b)中限定的可变结构域的构架序列移植有得自其它来源的CDR。
[0017]在一个优选实施方案中，所述靶分子是选自下组的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、单臂(one armed)人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一个优选实施方案中，所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。
[0018]或者或与早前的优选实施方案组合，在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白结合CHl结构域的表位，所述表位包含一或多个氨基酸:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和/或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号。
[0019]或者或与早前的优选实施方案组合，在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白是:a)抗体；b)包含完整抗原结合位点的抗体片段；c)没有轻链的单结构域重链抗体；d)包含完整抗原结合位点的没有轻链的单结构域重链抗体的片段；或者e)包含完整抗原结合位点的免疫球蛋白衍生的可变结构域。优选地，所述抗原结合蛋白是骆驼VHH或骆驼化VH0
[0020]在优选的实施方案中，本发明涉及纯化靶分子的方法，所述方法包括在如前述实施方案限定的方法中用免疫吸附材料捕获靶分子，其中所述方法进一步包括步骤:c)在降低靶分子与免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收靶分子。在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白不结合游离轻链，更优选不结合人抗体的游离轻链，更优选不结合人IgG的轻链。
[0021]在一个方面，本发明涉及纯化包含人IgG-CHl结构域的Fab片段而不共纯化游离轻链的方法，其中所述方法包括步骤:a)将包含靶分子和游离轻链的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；b)使得靶分子通过特异性结合抗原结合蛋白而被免疫吸附材料捕获；及(3)在降低靶分子与免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收靶分子；其中所述抗原结合蛋白如前述任一实施方案限定。
[0022]在一个方面，本发明涉及从液体中吸附包含人IgG-CHl结构域的靶分子的体外方法，所述方法包括将免疫吸附材料与液体接触的步骤，其中所述免疫吸附材料包含固定化于载体上的如前述任一实施方案限定的抗原结合蛋白，及其中优选抗原结合蛋白通过共价连接固定化于载体上。
[0023]在一个方面，本发明涉及前述任一实施方案限定的抗原结合蛋白。
[0024]在一个方面，本发明进一步涉及包含编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。
[0025]在一个方面，本发明进一步涉及包含本发明的核酸的宿主细胞。
[0026]在一个方面，本发明涉及产生本发明的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在有助于所述抗原结合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞的步骤。
[0027]在进一步的方面，本发明涉及包含本发明的抗原结合蛋白的免疫吸附材料。
[0028]在进一步的方面，本发明涉及本发明的抗原结合蛋白或本发明的免疫吸附材料用于检测和/或纯化包含人IgG-CHl结构域的靶分子的用途，优选用于体外检测和/或体外纯化包含人IgG-CHl结构域的靶分子的用途。在一个优选实施方案中，所述靶分子是选自下组的分子:人或人源化IgGl、人或人源化IgG2、人或人源化IgG3、人或人源化IgG4、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一个优选实施方案中，所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化I gG消化物。在一个优选实施方案中，所述靶分子是人IgG或者人或人源化IgG Fab而无游离轻链的共结合。在一个优选实施方案中，所述靶分子是存在游离轻链的人IgG Fab。
[0029]发明描述
[0030]
[0031]“序列相同性”或“相同性”在本文定义为通过比较序列而确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性"还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，可以通过这种序列串之间的匹配而确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列而确定。“相同性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算。术语“序列相同性”或“序列相似性”是指两个(多)肽或两个核苷酸序列当优选在(至少进行比较的最短序列的)整个长度上最佳排列对比时并且如通过程序Clustalffd.83)、GAP或BESTFIT使用默认参数使匹配数最大化及使缺口数最小化，共享至少一定百分比的序列相同性，如在本文它处定义。GAP使用Needleman and Wunsch全局对比算法在它们的整个长度上对比两个序列，使匹配数最大化及缺口数最小化。一般地，使用GAP默认参数，缺口产生罚分=50。Clustalffd.83)使用blosum矩阵及默认设置(Gap开口罚分(opening penalty):10 ;Gap延长罚分(extension penalty):0.05)。用于序列相同性百分比的序列对比及评分可以使用计算机程序如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,得自 Accelrys Inc., 9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA 确定,或者使用开放来源软件如程序“needle〃(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water’’(使用局部Smith Waterman算法)于(核苷酸)/ 8 (蛋白质)和缺口延长罚分=3 (核苷酸)/ 2(蛋白质)而确定。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna,对于蛋白质,默认评分矩阵是 Blosum62 (Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。用于对比本发明的蛋白质序列的优选的多对比程序EmbossWIN version2.10.0，使用如上述GAP相同的参数，或者使用默认设置(对于“needle”及“water”以及对于蛋白质及DNA对比，默认Gap开口罚分是10.0，默认缺口延长罚分是0.5 ;默认评分矩阵对于蛋白质是Blossum62，对于DNA是DNAFulI)。当序列具有实质上不同的整体长度时，优选局部对比，如使用Smith Waterman算法的那些。或者，相似性或相同性百分比可以通过用例如FASTA、BLAST等算法对公共数据库进行检索而确定。[0032]抗体或免疫球蛋白(Ig)上下文中的“同种型”在本文用于定义已知为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的抗体同种型。“人IgG亚类”在本文用于指示IgGU IgG2、IgG3和IgG4。
[0033]“静脉内免疫球蛋白”或“IVIG”是静脉内施用的血液产品。其含有从超过1000个血液供体的血浆提取的混合IgG。IVIG用于治疗免疫缺陷如X连锁无丙种球蛋白血症、低丙球蛋白血症、特征为低抗体水平的获得性免疫功能低下病症、炎性及自身免疫疾病和急性感染。IVIG作为血浆蛋白替代治疗(IgG)而给予具有降低或缺乏抗体产生能力的免疫缺陷患者。IVIG也由于各种其它病症，如同种骨髓移植、慢性淋巴细胞白血病、特发性血小板减少性紫癜、peiatric HIV、原发性免疫缺陷、川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、具有高抗体受体或具有ABO不相容供体的肾移植、孤独症、慢性疲劳综合征、艰难梭菌(Clostridium difficile)结肠炎、皮肌炎和多肌炎、graves 眼病、guillain_Barr6 综合征、肌营养不良和包涵体myuositis。
[0034]表位(也已知为“抗原决定簇”)定义为由抗原结合蛋白结合的靶分子的一部分。识别表位的抗原结合蛋白部分称为互补位。蛋白质靶分子的表位基于它们的结构及与互补位的相互作用分为两类:构象表位和线性表位。构象表位由靶分子氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位基于靶分子的三维表面特征和形状或三级结构而与互补位相互作用。相反，线性表位基于它们的一级结构与互补位相互作用。组成线性表位的氨基酸是来自靶分子的连续氨基酸序列。当抗原结合蛋白是抗体时，表位是用这个分子免疫个体脊椎动物宿主时引起免疫学应答的靶分子部分。通常其是发生结合抗体的靶分子的位点。表位优选天然存在于靶分子中。任选地，表位是已人工包括在靶分子中的序列。任选地，多个相同或不同表位被包括在靶分子中以便于其纯化及检测。
[0035]术语“特异性结合”或“结合”如本文用于指抗原结合蛋白和靶分子的相互作用时是指抗原结合蛋白识别靶分子及所述相互作用依赖于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，抗原结合蛋白识别并结合特异性靶分子结构而非一般而言的蛋白质。可以结合特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)、可以特异性结合特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)、对特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)具有亲和性和/或对特异性靶分子(抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质)具有特异性的本发明的抗原结合蛋白可以被称为“抗”或“针对”所述靶分子。术语“特异性”是指特定抗原结合蛋白分子可以结合的不同类型抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合蛋白的特异性可以基于亲和性和/或亲合力(aviditV)确定。亲和性由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(Kd)代表，是抗原决定簇与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间的结合强度的测量。或者，亲和性也可以表示为亲和性常数(Ka)，其是I / KD。根据抗原结合蛋白和感兴趣抗原的特异组合，亲和性可以以已知方式确定。亲合力在本文是指具有多个结合位点的靶分子与更大的结合剂复合物的结合强度，即多价结合的结合强度。亲合力与抗原决定簇及其在抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及抗原结合分子上存在的结合位点数相关。另一方面，亲和性是指简单的单价受体配体系统。
[0036]术语肽和多肽在本文同义使用，是指这类化合物而不限制大小。这个类别的最大成员称为蛋白质。
[0037]发明详沭
[0038]本发明人发现了一种用于选择性捕获和/或纯化靶分子的新方法，所述靶分子包含人IgG-CHl结构域，包括人或人源化IgGl、IgG2、IgG3、IgG4抗体和/或其片段，其中所述方法包括一特定类别的抗原结合蛋白，用于掺入和/或附着于免疫吸附材料。用于本方法中的抗原结合蛋白优选通过结合存在于人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4每种的CHl结构域中的表位而起作用，因此不依赖于IgG-Fc结构域。用于本发明方法中的抗原结合蛋白优选结合仅存在于IgG同种型的抗体重链的CHl结构域上的独特表位。另外，用于本发明方法中的抗原结合蛋白优选不结合除IgG之外的人重链抗体同种型，也不结合来自例如牛和猪的IgG抗体。更优选地，所述抗原结合蛋白显示在温和条件下(例如pH >3)有效的洗脱，即释放靶分子。用于本发明方法中的抗原结合蛋白具有不依赖于轻链类型和VH亚类的特异性结合人IgG抗体和/或Fab (片段抗原结合)片段或其它包含4种人IgG亚类之一的人IgG-CHl结构域的片段所需的亲和性和选择性。通过选择性结合人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的CHl结构域，本发明的抗原结合蛋白可以用于捕获和/或纯化任何人IgG衍生的Fab片段而不依赖于其IgG亚类、轻链同种型及VH亚类。这种选择性进一步导致明显益处，即没有对可能存在于源自例如重组表达系统和/或胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理的IgG消化产物的原料中的游离抗体轻链和/或IgG Fe片段的交叉结合。这种选择性是独特的，现有技术中已知的任何抗原结合蛋白均未证实这种选择性。令人感兴趣地，直至今日本发明人未发现任何人报道了特异于所有同种型的人IgG抗体的CHl结构域上的表位的抗原结合蛋白。
[0039]本发明提供了通用工具，用于同种型特异性捕获和/或纯化人IgG抗体和/或其Fab片段，不依赖于所述人IgG抗体或Fab片段的IgG亚类、轻链类型及VH亚类，由此例如不需要不同类型结合剂和/或方法以使得纯化完整系列的人IgG抗体靶。
[0040]因此，本发明的抗原结合蛋白能够选择性捕获和/或纯化所有人IgG衍生的Fab片段，不显示对可能存在于原料中的游离抗体轻链和/或IgG Fe片段的交叉反应性。现有技术中已知的结合剂无一能选择性纯化人IgG Fab而不显示对游离轻链的交叉反应性(例如蛋白L、KappaSelect、FabSorbent)或对IgG Fe结构域的交叉反应性(例如蛋白A和G),这些结合剂自己也不能覆盖纯化衍生自所有4种`IgG亚类的所有类型的Fab片段。另外，由于蛋白A和G结合IgG Fe结构域,蛋白A和G不能用于从由人IgG Fe和Fab片段的混合物组成的原料样品选择性捕获人IgG衍生的Fab片段。
[0041]因为本发明的结合剂显示对所有4种不同人IgG亚类抗体的CHl结构域的相似的结合特征，其使得能在温和洗脱条件下从例如人血浆衍生的原料样品选择性纯化多克隆IgG而不改变起始材料的IgG亚类分布，在其中免疫吸附材料被过载情况中不依赖于临界点(breakthrough)的百分比。
[0042]在第一个方面，本发明涉及捕获包含人IgG-CHl结构域所示氨基酸序列的靶分子的方法。所示方法优选包括步骤:a)将包含靶分子的组合物与优选固定化于支持物上的包含本发明的抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及《使得靶分子通过特异结合抗原结合蛋白而用免疫吸附材料捕获，优选在使得靶分子与免疫吸附材料中的抗原结合蛋白结合的条件下进行。我们现在首先描述本发明的抗原结合蛋白。
[0043]抗原结合蛋白
[0044]在第二个方面，本发明涉及特异性结合单表位的抗原结合蛋白，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和IgG4每种的CHl结构域中。优选地，本发明的抗原结合蛋白能够特异性结合人IgG的CHl结构域中存在的表位，所述表位也能特异性地被具有选自SEQID NO:1-158的氨基酸序列的一或多个VHH(参考VHH)结合。本发明抗原结合蛋白与也被至少一个参考VHH特异性结合的人IgG的CHl结构域中的表位的结合优选通过所述抗原结合蛋白交叉阻断一或多个参考VHH(即SEQ ID NO:1-158的任一或多个)对该表位的结合的能力确定。
[0045]因此，本发明的优选的抗原结合蛋白具有交叉阻断具有选自SEQ IDNO:1-158的氨基酸序列的一或多个VHH结合包含人CHl结构域的靶分子例如SED ID N0:28的能力。抗原结合蛋白交叉阻断参考VHH的结合的能力在本文定义为当靶分子首先被抗原结合蛋白结合时其使参考VHH与包含人IgG的CHl结构域的合适靶分子的结合降低至少10%、20%、50 %、75 %、90 %、95 %、99 %、99.9 %或99.99 %的能力，或者反之亦然(即当靶分子首先被参考VHH结合时抗原结合蛋白的结合被降低)。
[0046]交叉阻断的能力原则上可以用任何类型免疫测定确定，优选竞争性免疫测定，包括例如ELISA、固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见 Stahli et al.，Methods in Enzymology9:242-253 (1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA (参见 Kirkland et al.，J.1mmunol.137:3614-3619 (1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow and Lane, " Antibodies, ALaboratory Manual, " Cold Spring Harbor Press (1988));使用 I125标记的固相直接标记RIA (参见 Morel et al., Molec.1mmunol.25(1):7-15(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA (Cheung et al., Virologyl76:546-552 (1990));及直接标记 RIA (Moldenhaueret al., Scand.J.1mmunol.32:77-82(1990))。
[0047]典型地，这种测定涉及使用结合于固相表面的纯化的靶分子、未标记的测试抗原结合蛋白及标记的参考VHH。竞争性抑制通过确定在测试抗原结合蛋白存在下结合于固相表面的标记的量而测量。通常测试抗原结合蛋白过量存在。合适的竞争性结合测定的例子例如如下所述。通过竞争测定鉴别的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考VHH结合相同表位的抗原结合蛋白及与相邻表位结合的抗原结合蛋白，所述相邻表位与由参考抗原结合蛋白结合的表位足够近而发生立体位阻。合适的靶分子是包含人CHl结构域的任何靶分子，如下定义包括例如人IgG及其Fab片段。
[0048]例如，人们可以在例如夹心ELISA设置中使用参考抗IgG-CHl VHH片段和待确定的抗原结合蛋白确定是否两个结合蛋白均能同时结合人IgGFab片段的CHl结构域。为此目的，参考抗IgG-CHl VHH片段优选包被在Maxisorp ELISA平板上并用在PBS中的2 %(w / V)奶粉(Protifar)封闭。作为对照，抗人Fab kappa轻链VHH片段(抗Fab-kappa)优选包被在无包被对照相邻处。然后使多克隆人IgG Fab片段结合固定化VHH片段I小时(10 Ug/ ml Fab 于在 PBS 中的 I % (w / v)奶粉和 0.05% (v / v) Tween-20 中，100 μ I /孔)。在洗涤后，结合的人Fab片段用其交叉阻断待确定的生物素化抗原结合蛋白或蛋白L(后者结合人Fab的VL-kappa结构域)检测，随后与HRPO缀合的链霉抗生物素蛋白保温以用于检测。
[0049]靶分子在本文中定义为由结合剂、优选本发明的抗原结合蛋白结合的分子。靶分子可以是需要捕获、纯化的蛋白质，或者需要从样品中被移除的蛋白质，或者待检测或鉴别的蛋白质。
[0050]在优选的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合包含人IgG-CHl结构域或其等位基因变体的靶分子。优选地，包含人IgG-CHl结构域的靶分子是选自下组的分子:人IgGl分子、人IgG2分子、人IgG3分子、人IgG4分子、人Fab、人F(ab’)2、单臂人抗体、单链人抗体、人源化IgGl分子、人源化IgG2分子、人源化IgG3分子、人源化IgG4分子、人源化Fab、人源化F(ab’)2、单臂人源化抗体、单链人源化抗体和IVIG。人源化抗体或抗体片段在本文应理解为嵌合抗体或抗体片段，其中一或多个恒定结构域的至少部分是人来源的，及其中一或多个CDR的至少部分不是人来源的。
[0051]本发明的抗原结合蛋白用于纯化IVIG的优势是保持亚类分布。本发明的抗原结合蛋白纯化Fab的优势是本发明的抗原结合蛋白不交叉结合游离轻链和Fe片段。在另一个实施方案，包含人IgG-CHl结构域的靶分子是重组蛋白质。所述重组蛋白质可以是融合蛋白或嵌合蛋白如人源化抗体。
[0052]代替或与前述实施方案组合，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合包含由SEQ IDNO:190-193任一氨基酸序列限定的人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的人IgG CHl结构域的革巴分子。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能选择性结合IgG CHl结构域的表位，所述表位由SEQ ID NO:194-200的任一氨基酸序列限定。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白不能选择性结合IgG CHl结构域的表位，所述表位由SEQ ID NO =201-217的任一氨基酸序列限定。
[0053]本发明的抗原结合蛋白优选不结合人非IgG相关抗体同种型、人IgG的Fe结构域、人IgG的Fv结构域或者人IgG的游离轻链。特别地，蛋白G和蛋白A不是本发明的抗
原结合蛋白。[0054]在优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合IgG同种型的人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗体重链的CHl结构域中存在的表位，其中与CHl结构域中的表位的结合对于4个人IgG亚类的每一个是相当于nM亲和性，即对4个亚类的每一个的亲和性的差异优选不超过一个数量级，更优选差异小于5、4、3或2倍。
[0055]在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白不结合选自下组的IgG的至少一个CHl结构域:兔IgG、猪IgGl、猪IgG2、牛IgGl、牛IgG2、绵羊IgGl、山羊IgGl、骆驼IgGla、骆驼IgGlb、大鼠IgGl、大鼠IgG2a、大鼠IgG2b、大鼠IgG2c、小鼠IgGl、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b和小鼠IgG3。[0056]人IgGl、A IgG2、人IgG3和/或人IgG4如本文所用可以是天然、完整(intact)或完全(complete)人IgGl、人IgG2、人IgG3和/或人IgG4。其也可以涵盖人源化IgGl、IgG2、IgG3 和 / 或 IgG4。
[0057]优选地，抗原结合蛋白与靶分子例如人IgG的结合及后续靶分子的洗脱不影响靶分子的效应物功能，这可以在已知测定中确定。还优选的是抗原结合蛋白与靶分子例如人IgG的结合及后续靶分子的洗脱不降低、抑制或另外影响靶分子与其预定抗原的结合。
[0058]在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白结合CHl结构域的表位，所述表位包含、涉及和/或者由一或多个氨基酸限定:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和/或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号(E.A.Kabat, T.T.Wu,
H.M.Perryj K.S.Gottesman and C.Foellerj Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (5th Edition)，NIH Publication N0.91-3242, U.S.Department Of Health andHuman Services, Public Health Service, National Institutes of Health(1991))。由此得出结论，本发明的抗原结合蛋白结合的CHl结构域的表位特别在122位不包含酪氨酸残基并且在156位不包含苏氨酸残基。更优选地，所述表位包含在156位的丝氨酸残基及在216位的天冬酰胺残基或者在156位的赖氨酸残基及在216位的丝氨酸残基。
[0059]由本发明的抗原结合蛋白识别的IgG抗体的CHl结构域上的表位与蛋白G识别的表位是不同的。例如，后者亲和性配体不区分在122位具有Phe或Tyr残基的CHl结构域，本发明的结合剂观测到这种区分(其不结合在122位具有Tyr的CHl结构域)。
[0060]为测试潜在的抗原结合蛋白是否能特异性结合靶分子但不结合另一个分子如人IgG Fe片段、Fv片段和/或轻链，优选可以进行如实施例所述的ELISA和/或表面等离子共振分析。
[0061]在一个优选实施方 案中，本发明的抗原结合蛋白包含一或多个单结合结构域，其中单结合结构域不包含轻链及其中单结合结构域包含全抗原结合能力。优选地，本发明的抗原结合蛋白选自下组:包含重链及没有轻链的抗体、其片段、affibody、单结构域抗体及其片段。本发明的抗原结合蛋白的例子是衍生自天然没有轻链的骆驼或鲨鱼仅重链抗体的VHH或者affibody。优选地,抗原结合蛋白是仅包含重链及天然没有轻链的抗体或者其抗体片段。或者，(及也是优选的)本发明的抗原结合蛋白可以例如通过修饰如突变衍生自天然没有轻链的抗体或者其片段。天然没有轻链的抗体可以通过免疫骆驼(例如美洲驼羊、骆驼、单峰骆驼、双峰骆驼、羊驼、骆马和原驼)或鲨鱼(见下述)而获得。这些抗体仅包含重链并且没有轻链。这些单结构域重链抗体的优势是它们特别稳定、小并且容易在宿主生物体如酿酒酵母中生产。
[0062]因此，本发明的抗原结合蛋白优选包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，其在一条单多肽链上包含针对靶分子上表位的完整抗原结合位点。这种抗原结合蛋白特别包括但不限于:
[0063]I)可得自骆驼和鲨鱼的抗体，仅由重链组成及天然没有轻链；
[0064]2)在I)中定义的抗体的可变结构域，通常称为VHH结构域；
[0065]3)在I)中定义的抗体或2)中的结构域的工程化形式，例如“骆驼化”抗体，其中骆驼(或鲨鱼)VHH结构域的构架序列用得自其它来源的⑶R移植；[0066]4)免疫球蛋白样可变结构域的工程化形式，其中来自各种免疫球蛋白样分子的构架序列与特异于给定靶分子的⑶R组合，例如如W004 / 108749所述。
[0067]在本发明的一个优选抗原结合蛋白中，包含全抗原结合能力的可变结构域的单多肽链优选具有被认为包含4个构架区或“FR”的氨基酸序列及结构，这些区域在本领域及在本文中分别被称为“构架区I”或“FR1”、“构架区2”或“FR2”、“构架区3”或“FR3”和“构架区4”或“FR4”，所述构架区由3个互补决定区或“⑶R”间断，所述互补决定区在本领域中分别被称为“互补决定区I”或“⑶R1”、“互补决定区2”或“⑶R2”和“互补决定区3”或“CDR3”。这些构架区和互补决定区优选以顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (从氨基末端到羧基末端)可操作连接。
[0068]在具有全抗原结合能力的可变结构域中的氨基酸残基总数可以在110-135范围内，优选在115-129范围内。但是，根据本发明具有全抗原结合能力的可变结构域不特别限制其长度和/或大小，只要该结构域满足本文所述的进一步功能要求和/或其适合本文描述的目的。具有全抗原结合能力的可变结构域的氨基酸残基根据Kabat et al.给出的 VH 结构域一般编号而编号(E.A.Kabat, T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman andC.Foeller, Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Edition), NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department Of Health and Human Services, PublicHealth Service, National Institutes of Health (1991)),如适用于 Riechmann andMuyldermans (1999, J.Tmmunol.Methods231 (1-2):25-38,例如参见所述文献图 2)及Harmsen et al.(2000,Molecular Immunology37:579-590,例如参见所述文献图1)的来自骆驼的VHH结构域。
[0069]根据这个编号，在具有全抗原结合能力的可变结构域中:FR1包含1-26位的氨基酸残基KDRl包含27-35位的氨基酸残基；FR2包含36-49位的氨基酸残基KDR2包含50-64位的氨基酸残基；FR3包含65-94位的氨基酸残基KDR3包含95-102位的氨基酸残基；及最终，FR4包含103-113位的氨基酸残基。
[0070]在这个方面，应注意，如本领域熟知的针对VH结构域及针对VHH结构域，在每个CDR中的氨基酸残基总数可能变化并且可能不相应于由Kabat编号指示的氨基酸残基总数。但是，基于构架区的保守氨基酸，本领域技术人员能够针对那些具有非113个氨基酸的长度的具有全抗原结合能力的可变结构域根据Kabat定义排列各自构架区和互补决定区。其例子在图1所示IgG-CHl的氨基酸序列中的互补决定区的定义中给出。对VH结构域的氨基酸残基编号的其它方法是Chothia et al.描述的也可以类似方式适用于来自骆驼的VHH结构域和具有全抗原结合能力的可变结构域的方法(Nature342，877-883 (1989))，所谓的“AbM definition”及所谓的“contact definition”,或者 IMGT 编号系统(Leffanc etal.，1999, Nucl.Acids Res.27:209-212)。
[0071]或者或与先前实施方案组合，在一个优选实施方案中，抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区，FRl至FR4，及3个互补决定区，⑶Rl至⑶R3，它们以顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4可操纵连接，其中:a)CDRl具有选自SEQ IDNo:159-162的氨基酸序列或者与SEQ ID No:159-162有1、2、3、4、5或6个氨基酸残基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有选自SEQ ID No =163-181的氨基酸序列或者与SEQ ID No:163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有选自 SEQ ID No:182-185 的氨基酸序列或者与 SEQ ID No:182-185 有 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；以及其中每个构架区与SEQ ID No:186-189任一个的构架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的氨基酸相同性。或者，抗原结合蛋白中的至少一个CDR是选自上述a)、b)和c)定义的CDR中的CDR。
[0072]在一个优选实施方案中，⑶Rl具有SEQ ID NO: 159或160的氨基酸序列。或者或与先前优选的实施方案组合，在本发明一个优选实施方案中，CDR2具有选自SEQ ID NO:163-168、SEQ ID NO:176-181的氨基酸序列。或者或与先前优选的实施方案组合，在本发明一个优选实施方案中，CDR3具有选自SEQ ID NO:182、SEQ ID N0:183和SEQ ID NO:184的氨基酸序列。
[0073]在本发明的一个优选抗原结合蛋白中，具有全抗原结合能力的可变结构域的构架氨基酸序列优选与SEQ ID No:186-189任一个的构架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的氨基酸相同性。
[0074]更优选地，在根据本发明的特异结合人IgG-CHl的可变结构域的单多肽链的FRl、FR2、FR3和FR4的每个位置(根据Kabat编号)存在的氨基酸残基如表1_4所示的FRl、FR2、FR3和FR4。对于每个位置，在每个位置最频繁存在的氨基酸残基以粗体示出。在这些残基以外，表1-4提供一些可以在天然发生的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的每个位置存在的非限制性残基(数据得自W02009 / 011572 ；PCT / NL2008 / 050460)。但是更优选地，具有全抗原结合能力的可变结构域的构架氨基酸残基选自在特异性结合人IgG-CHl的抗原结合蛋白的SEQ ID勵:186-189任一个的氨基酸序列的？1?1、？1?2、？1?3和？1?4的每个位置(根据Kabat编号)存在的表1-4中的氨基酸残基。对于每个位置，在每个位置最频繁出现的氨基酸残基在表1-4中以粗体指示。
[0075]因此，在本发明一个优选实施方案中，基于表1-4所述的位置上存在的氨基酸残基，在本发明的抗原结合蛋白中的包`含全抗原结合能力的可变结构域的氨基酸序列可以具有结构:
[0076]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0077]其中，FRl具有选自如下的氨基酸序列:
[0078]a)[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSG[26](SEQ ID:186)；
[0079]b)与 a)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，
[0080]c)具有如表I定义的一或多个氨基酸取代的a)的氨基酸序列；
[0081]其中，FR2选自如下的氨基酸序列:
[0082]d)[36]WFRQTPGNEREFVA[49](SEQ ID:187)；
[0083]e)与 d)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或
[0084]f)具有如表2定义的一或多个氨基酸取代的d)的氨基酸序列；
[0085]其中，FR3选自如下的氨基酸序列:
[0086]g) [65]GRFTISRDSGKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAG[94](SEQ ID:188)；
[0087]h)与 g)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，[0088]i)具有如表3定义的一或多个氨基酸取代的g)的氨基酸序列；以及，
[0089]其中，FR4选自如下的氨基酸序列:
[0090]j)[103]WGQGTQVTVSS[113] (SEQ ID:189)；
[0091]k)与 j)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，
[0092]I)具有如表4定义的一或多个氨基酸取代的i)的氨基酸序列。
[0093]在一个替代优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含如图1各行之一给出的⑶R1、⑶R2和⑶R3组合，其中构架区(FRl至FR4)可以是上述定义的任何构架区(FRl至FR4)，更优选是图1中同一行的构架区。更优选地，本发明的抗原结合蛋白包含图1各行之一给出的⑶R1XDR2和⑶R3组合，其中抗原结合蛋白具有与图1同一行提供的全部氨基酸序列的序列具有至少90 、95、98、99或100%序列相同性的氨基酸序列。
[0094]在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含与SEQ ID No:1_158的氨基酸序列的任一个具有至少85%、优选至少90%、更优选至少93、95、97、98、99或100%相同性的氨基酸序列，更优选其中抗原结合蛋白由与SEQ ID No:1-158的氨基酸序列的任一个具有至少90%、更优选至少93、95、97、98、99或100%相同性的氨基酸序列组成。
[0095]本发明的抗原结合蛋白是以希望的结合亲和性(如本文定义)特异结合靶分子的成分。本发明的抗原结合蛋白优选是单特异性抗原结合蛋白。应理解包含单特异性抗原结合蛋白的组合物如本发明的免疫吸附材料是指具有均一抗原结合蛋白群的组合物。由此，单特异性抗原结合蛋白特异于单一表位。但是明确包括在本发明中的是免疫吸附材料可包含超过一种类型的单特异性抗原结合蛋白，每个由均匀群组成。但是通常在本发明上下文中，免疫吸附材料不包含超过4、6、8、10或20种不同的单特异性抗原结合蛋白。抗原结合蛋白通常是抗体或其片段，其中单特异性抗原结合蛋白由此是单克隆抗体或其片段，其可得自克隆的细胞系(例如杂交瘤)或者表达自克隆的编码序列。术语单特异性抗原结合蛋白如本文所用由此排除多克隆抗体和抗血清。
[0096]典型地，本发明的抗原结合蛋白结合靶分子的解离常数(Kd)为大约10_5至10_12M或更低，优选为10_7至10_12M或更低，更优选为10_8至10_12M或更低，和/或结合亲和性为至少IO-7M,优选至少IO-8M,更优选至少IO-9M,如至少10,、10'IO-12M或更多。任何大于10_4M(即小于ΙΟΟμΜ)的Kd值通常被认为是指示非特异性结合。优选地，本发明多肽以低于500ηΜ、优选低于200ηΜ、更优选低于ΙΟηΜ、如低于500pM的亲和性结合希望的抗原。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何已知的合适方式确定，包括例如Scatchard分析和/或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心竞争测定以及本领域已知的其不同变体(也见上述)。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白以上述定义的亲和性结合希望的抗原，而这个亲和性与在温和洗脱条件下抗原从抗原结合蛋白的有效释放组合。
[0097]温和洗脱条件在本文中应理解为这样的条件，在所述条件下抗原活性和/或完整性(例如二级/三级结构)仅稍受影响(例如失活或变性低于10% )，优选抗原活性和/或完整性没有可检测的降低。这种温和洗脱条件的例子包括例如本文下述的酸性条件，包括例如0.1M甘氨酸或0.02M柠檬酸PH3.0或ρΗ4.0，0.IM精氨酸ρΗ4.0或ρΗ5.0。在(近)中性PH的温和洗脱条件的其它例子包括例如高离子强度，如条件等价于2Μ NaCl或2M MgC12(在例如20mM Tris pH8.0中)或者离液剂如乙二醇或丙二醇(40_60%，优选大约 50% (V / V)，在例如 20mM 咪唑，IOmM CaCl2,0.01 % Tween80，250mMNaCl 中，ρΗ7.0)。在ΡΗ3.0下释放抗原的本发明抗原结合蛋白的例子包括具有本文上述定义的结构的抗原结合蛋白，其中:a)CDRl具有选自SEQ IDNo: 159-162的氨基酸序列或者与SEQ ID No =159-162有1、2、3、4、5或6个氨基酸残基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有选自SEQ ID No =163-181的氨基酸序列或者与SEQ ID No:163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有选自SEQ ID No =182-189的氨基酸序列或者与SEQ ID No:182-189有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同的氨基酸序列。更优选地，所述抗原结合蛋白具有选自SEQ ID Nol-158的氨基酸序列。
[0098]结合人IgGl、人IgG2、人IgG3及人IgG4分子的CHl结构域的本发明的抗原结合蛋白是优选具有选自如下一或多种性质的抗原结合蛋白:a)抗原结合蛋白以至少10_7M、10_8M或10-9Μ的结合亲和性结合人IgG分子,如实施例所述经BiaCore分析；b)抗原结合蛋白可表达得自酵母，表达水平为至少0.5、0.8、1.0g / L酵母培养物。
[0099]在一个实施方案中，本发明涉及特定形式的本发明抗原结合蛋白:多价抗原结合蛋白。所述多价抗原结合蛋白包含至少两个本文上述定义的抗原结合蛋白的氨基酸序列。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列可以彼此不同或者它们可以相同，例如一个氨基酸序列的拷贝或重复。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列通常头至尾融合，即最N-末端序列的C-末端融合于第二个序列的N-末端等等。至少两个抗原结合蛋白的氨基酸序列可以直接连接融合或者经接头或间隔基融合。本发明的多价抗原结合蛋白可以通过表达编码多价蛋白的核苷酸序列而产生，其中两个或更多个抗原结合蛋白的编码序列可操纵连接在相同读框中。本领域技术人员知道如何可操纵融合蛋白编码序列。多价抗原结合蛋白的优势是动力学结合能力改善，特别是如果多价抗原结合结构域例如用共价结合定向固定化于固体支持物上时。
[0100]本发明的抗原结合蛋白还包括修饰形式，其中氨基酸残基用赖氨酸残基取代以提高等电点(PD。是SEQ ID NO:1的修饰形式的这种抗原结合蛋白的例子如SEQ ID No:10，19，28，37，46，55，64和73所示。具有7以上pi的抗原结合蛋白比具有低于7的pi的抗原结合蛋白更容易纯化，其中纯 化例如是从一个来源如酵母发酵液经离子交换层析进行。
[0101]抗原结合蛋白的其它有利修饰形式是例如这样的形式，其中抗原结合蛋白具有改良的稳定性，例如改良的苛性稳定性(caustic stability),改良的对变性剂的稳定性和/或改良的蛋白酶稳定性。是SEQ ID NO:28的修饰形式的这种抗原结合蛋白的例子如SEQID No:29-36，117-137所示。本领域技术人员知道一些氨基酸残基对于多肽或蛋白质的稳定性是不利的。例如，在脱酰胺反应中，谷氨酰胺或天冬酰胺残基的侧链酰胺键水解形成游离羧酸。如 Bischoffet al (J.0fChrom B (1994)，622，261-278)所述，可以发生肽和蛋白质中的天冬酰胺(Asn，N)及谷氨酰胺(Gin，Q)残基的非酶促脱酰胺，酰胺键的水解在碱性条件下显著加速，特别是当例如天冬酰胺后面是甘氨酸(Gly，G)或丝氨酸(Ser，S)残基时。在这个方面，天冬酰胺比相应位置的谷氨酰胺更易于脱酰胺。在Bischoffet al.中，提供了在肽或蛋白质序列内的展示较低不稳定天冬酰胺残基的残基组合及因此可以掺入例如基于通常存在的VHH序列中，-或者残基的替代组合以增加碱稳定性。另外，Geiger etal (J.0f Biol Chem (1987) vol.262，n0.2，785-794)描述了除天冬酰胺残基，天冬氨酸残基(Asp,D)也可以是用于蛋白质的非酶促降解的热点。在这个方面,Terashima et al (Anal.Biochem.(2007) ,368,49-60)描述了当甘氨酸(Gly,G)在天冬氨酸残基的C-末端时,天冬氨酸(Asp，D)的异构化被加速，因此可以如上所述设想其它残基组合以增加抗IgG-CHl抗原结合蛋白的稳定性 。
【权利要求】
1.捕获包含人IgG-CHl结构域的靶分子的方法，其中所述方法包括步骤: a)将包含所述靶分子的样品与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触；及， b)使得所述靶分子通过特异性结合所述抗原结合蛋白而被所述免疫吸附材料捕获； 其中所述抗原结合蛋白能够结合单一表位，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CHl结构域中，其中所述抗原结合蛋白被具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH交叉阻断，及其中所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域包含针对所述表位的完整抗原结合位点。
2.权利要求1的方法，其中所述抗原结合蛋白包含: a)可得自骆驼或鲨鱼的抗体，所述抗体仅由重链组成并且天然没有轻链； b)在a)中限定的抗体的可变结构域；或者， c)可变结构域，其中在b)中限定的可变结构域的构架序列移植了得自其它来源的CDR。
3.权利要求1或2 的方法，其中所述靶分子是选自下组的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。
4.权利要求3的方法，其中所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述抗原结合蛋白结合所述CHl结构域的表位，所述表位包含如下的一或多个氨基酸:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是单个半胱氨酸，在156位的丝氨酸或赖氨酸和/或在216位的天冬酰胺或丝氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat编号。
6.前述任一权利要求的方法，其中所述抗原结合蛋白是骆驼VHH或骆驼源化VH。
7.纯化靶分子的方法，所述方法包括在权利要求1-6任一项定义的方法中用免疫吸附材料捕获所述靶分子，其中所述方法进一步包括步骤: c)在降低所述靶分子与所述免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收所述靶分子。
8.权利要求7的纯化靶分子的方法，其中所述抗原结合蛋白不结合游离轻链。
9.纯化包含人IgG-CHl结构域的Fab片段而不共纯化游离轻链的方法，其中所述方法包括步骤: a)将包含所述靶分子和游离轻链的样品与与固定化于支持物上的包含抗原结合蛋白的免疫吸附材料接触； b)使得所述靶分子通过特异性结合所述抗原结合蛋白而被所述免疫吸附材料捕获；及 c)在降低所述靶分子与所述免疫吸附材料之间的亲和性的条件下洗脱结合的靶分子，及任选地回收所述靶分子； 其中所述抗原结合蛋白如权利要求1、2、5和6任一项所限定。
10.从液体中吸附包含人IgG-CHl结构域的靶分子的体外方法，所述方法包括将免疫吸附材料与所述液体接触的步骤，其中所述免疫吸附材料包含固定化于载体上的权利要求.1、2、5和6任一项限定的抗原结合蛋白，及其中优选地所述抗原结合蛋白通过共价连接固定化于所述载体上。
11.权利要求1、2、5和6任一项限定的抗原结合蛋白。
12.包含编码权利要求11的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。
13.包含权利要求12的核酸的宿主细胞。
14.产生权利要求11的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在有助于表达所述抗原结合蛋白的条件下培养权利要求12的宿主细胞的步骤。
15.包含权利要求11的抗原结合蛋白的免疫吸附材料。
16.权利要求11的抗原结合蛋白或权利要求15的免疫吸附材料用于体外检测和/或体外纯化包含人IgG-CHl结构域的靶分子的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述靶分子是选自下组中的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgGFab、人或人源化 IgG F(ab’)2、单臂人或人源化IgG抗体、单链人或人源化IgG抗体、IVIG及人或人源化IgG消化物。
18.权利要求17的用途，其中所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化IgG消化物。
19.权利要求17的用途，其中所述靶分子是没有游离轻链共结合的人IgG或者人或人源化 IgG Fab0
【文档编号】C07K1/22GK103459427SQ201280015886
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年1月31日 优先权日:2011年2月1日
【发明者】W·J·J·赫尔曼斯, S·布洛克兰, M·A·范克斯特伦, J·M·霍勒弗特, F·J·M·德特默斯 申请人:Bac Ip私人有限公司