一种基于过氧化氢试纸条进行免疫分析的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种基于过氧化氢试纸条进行免疫分析的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]可视化快速检测技术具有信号读出简单、不需要任何仪器而可直接用裸眼进行观察等优点，特别适合现场、快速和床边的检测，因此在临床诊断、食品安全、环境监测等领域得到了广泛的应用。目前，可视化的快速检测技术主要包括:(1)基于化学反应导致的颜色改变，例如pH试纸；(2)基于纳米材料的本身颜色改变，实现可视化检测，最经典的是胶体金免疫层析试纸条，该方法具有成本低、快速、简便、无需仪器及携带方便、适合现场检测等优点，但是，该方法灵敏度较低，难以满足痕量目标物检测的需要。例如一些重要的传染病诊断、食品和环境中有毒、有害物质的超痕量检测等领域都需要高灵敏度的可视化分析方法。另外也有些研究表明分散状态的金颗粒，通过反应其状态从分散变成聚集后，颗粒间的等离子体耦合会发生改变，吸收峰发生红移，溶液的颜色由红色变为紫色或蓝色，从而实现对目标物的检测，该检测方法具有简便快捷，成本低廉、选择性好、肉眼可见、无需大型仪器等优点，是一种具有应用潜力的分析检测方法。但这种依赖改变溶液中胶体金溶液状态改变的方法需要对胶体金表面进行特别的修饰，操作比较麻烦，适合检测简单的样品，例如水样中的重金属等等，但在复杂的生物样品中，该方法的抗干扰能力差，灵敏度仍然达不到实际样品的要求。(3)基于酶和底物之间的显色反应，例如辣根过氧化物酶(HRP)和底物TMB之间的特异性酶促反应会有蓝色产生，根据蓝色的深浅可以判断样品中目标物的含量，其中应用最为广泛的酶联免疫分析方法(ELISA)就是基于HRP酶和底物之间的高效催化的免疫分析方法，该方法最大的优点是酶的催化效率很高，因此该方法的灵敏度比传统的胶体金免疫层析试纸条的灵敏度高一个数量级。但该方法酶和底物之间的反应需要添加终止液进行终止，操作比较繁琐，不利于快速检测，同时该方法的定量还需要一个酶标仪配套分析，但酶标仪比较笨重，一般不适合现场快速检测。因此，开发一种灵敏度高、读出方式简便的分析方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对目前胶体金免疫层析试纸条灵敏度低和酶联免疫分析方法在信号读出方面比较繁琐的问题，而提供一种基于过氧化氢试纸条进行免疫分析的方法及其应用。本发明的方法灵敏度高，数据读取方式简便，且无需检测仪器即可进行基本的可视化判断，若结合其手持式的定量检测仪器，即可进行精确定量检测。因此，本发明为疾病的早期诊断、环境监测、食品安全等领域提供了一种快速和高灵敏度的分析方法。
[0004]为实现上述目的，本发明提供下述技术方案。
[0005]本发明提供的技术方案之一是:一种基于过氧化氢试纸条进行免疫分析的方法，其包括如下步骤:
[0006](1)将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗；
[0007](2)加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液进行冲洗；
[0008](3)加入以葡萄糖氧化酶标记的二抗，孵育后用缓冲液进行冲洗，所述二抗为抗待测物的抗体；
[0009](4)加入葡萄糖溶液进行反应，吸取反应后的溶液于过氧化氢试纸条上，显色后获得结果I ;
[0010](5)将步骤(2)中所述的不同浓度梯度的待测物标准品溶液替换成待测样品溶液，重复进行步骤(1)?(4)的操作，显色后获得结果II，将结果II参比结果I，判断待测样品溶液中待测物的浓度；
[0011]其中，当待测物为完全抗原时，所述包被物质为能够与所述完全抗原对应结合且与所述二抗具有不同抗原结合位点的抗体，当待测物为抗体时，所述包被物质为与所述抗体对应的完全抗原或半抗原分子与蛋白质载体偶联形成的人工抗原。
[0012]本发明中，步骤(1)为:将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗。
[0013]如本领域常规，所述的包被物质为捕获物质，一般是抗体，如果是半抗原分子，则将半抗原分子与蛋白质载体偶联后再进行包被。所述的包被物质能够特异性结合步骤(2)中所述的待测物。
[0014]所述的固相载体为免疫检测领域常规所述的各类固相载体，其对于具体材质和规格并没有特殊的要求，只要其适于包被以及进行其他常规免疫反应操作即可。优选地，所述的固相载体为酶标板，本领域各种常规材质和规格的酶标板均适用于本发明。
[0015]所述孵育为本领域的常规操作，一般是将包被后的固相载体置于合适的温度条件下放置数小时，待包被物质牢固吸附于固相载体上即可。优选地，所述孵育为将包被后的固相载体置于4?40°C放置0.5?12小时，更优选于37°C放置2小时。
[0016]所述缓冲液为本领域常规，各类用于冲洗过量包被物质的缓冲液均适用于本发明，可以视不同的检测反应体系而进行具体选择。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1%。吐温-20的PBS缓冲液，所述千分比指体积千分比。
[0017]所述冲洗为本领域的常规操作，一般是往固相载体上加入缓冲液，静置数分钟后用净拍干，一般冲洗数次。
[0018]本发明中，步骤(2)为:加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液进行冲洗。
[0019]其中，所述的待测物为待检测的物质，其与步骤(1)中所述的包被物质能够发生特异性的结合，其属性一般为完全抗原或者是抗体。所述抗体的来源没有特别限制，如可以是将步骤(1)中所述的包被物质免疫各类哺乳动物而获得的抗体，如鼠抗或兔抗，其类型也没有特殊要求，既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
[0020]所述孵育同步骤(1)，其是本领域的常规操作，一般是将固相载体置于合适的温度条件下放置数小时，待添加物牢固吸附于固相载体上即可。优选地，所述孵育为将固相载体置于4?40°C放置0.5?12小时，更优选于37°C放置2小时。
[0021]所述缓冲液同步骤(1)，其为本领域常规，各类用于冲洗过量添加物的缓冲液均适用于本发明，可以视不同的检测反应体系而进行具体选择。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1%。吐温-20的PBS缓冲液，所述千分比指体积千分比。
[0022]所述冲洗同步骤(1)，其为本领域的常规操作，一般是往固相载体上加入缓冲液，静置数分钟后甩净拍干，一般冲洗数次。
[0023]本发明中，步骤(3)为:加入以葡萄糖氧化酶标记的二抗，孵育后用缓冲液进行冲洗，所述二抗为抗待测物的抗体。
[0024]其中，所述葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)也称GOD或G0X，其可以催化葡萄糖生成过氧化氢。
[0025]所述二抗的来源没有特别限制，如可以是将步骤(2)中所述的待测物免疫各类哺乳动物而获得的抗体，如羊抗、马抗等，其类型也没有特殊要求，既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
[0026]所述孵育同步骤(1)，其是本领域的常规操作，一般是将固相载体置于合适的温度条件下放置数小时，待添加物牢固吸附于固相载体上即可。优选地，所述孵育为将固相载体置于4?40°C放置0.5?12小时，更优选于37°C放置2小时。
[0027]所述缓冲液同步骤⑴，其为本领域常规，各类用于冲洗过量添加物的缓冲液均适用于本发明，可以视不同的检测反应体系而进行具体选择。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1%。吐温-20的PBS缓冲液，所述千分比指体积千分比。
[0028]所述冲洗同步骤(1)，其为本领域的常规操作，一般是往固相载体上加入缓冲液，静置数分钟后甩净拍干，一般冲洗数次。
[0029]本发明中，步骤(4)为:加入葡萄糖溶液进行反应，吸取反应后的溶液于过氧化氢试纸条上，显色后获得结果I。
[0030]其中，所述葡萄糖溶液为本领域常规，即将一定量的葡萄糖溶于水即可，所述葡萄糖溶液的浓度优选0.1?50mmol/L，更优选5mmol/L。
[0031]所述反应为本领域常规，优选于37°C反应lOmin。
[0032]所述过氧化氢试纸条为本领域常规市售可得的产品，优选德国默克公司生产的过氧化氢试纸条，该试纸条还可跟与其配套的手持检测仪一起使用，从而达到快速准确定量检测待测物的目的。
[0033]所述获得结果I的方式为本领域常规，如在吸取反应后的溶液于过氧化氢试纸条上后，不借助任何检测仪器而仅凭肉眼即可观察结果，一定浓度的待测物标准品溶液对应于特定深浅度的显色，可以为后续检测待测样品提供参比依据，达到定性或者简单定量的目的。获得结果I还可以借助于跟过氧化氢试纸条配套的手持检测仪进行，以获得精确的数据，或者进一步地，还可以在获得精确数据之后，制作反映待测物标准品浓度的标准曲线，从而为后续检测待测样品提供参比依据，达到快速检测和精确定量的目的。
[0034]本发明中，步骤(5)为:将步骤⑵中