述 核酸分子包含选自SEQ ID NO :27和SEQ ID NO :28的核酸序列。
[0108] 以举例的方式，本发明还提供突变的metA等位基因的多种组合和相应的分离的 核酸分子，其包含编码以下MetA中氨基酸取代的核酸序列：在氨基酸位置27用半胱氨酸取 代精氨酸（R27C);在氨基酸位置64用谷氨酸取代谷氨酰胺（Q64E);在氨基酸位置294用 半胱氨酸取代酪氨酸（Y294C);在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸（I296S);在氨基 酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸（P298L);以及在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸 (I296S)和在氨基酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸（P298L)。在一些方面中，由本发明提供 的突变的metA等位基因导致反馈抗性（即，反馈不敏感的）MetA酶。氨基酸位置是参照示 于图7A和SEQ ID NO :29的野生型MetA氨基酸序列。
[0109] 以举例的方式，本发明还提供突变的metK等位基因的多种组合和包含编码以 下MetK中氨基酸取代的核酸序列的相应的分尚的核酸分子：在氨基酸位置185用谷氨 酸取代缬氨酸（V185E)。本发明还提供在metK等位基因位置1132含有胞嘧啶碱基缺失 (cll32del)的核酸序列。在一些方面，由本发明提供的突变的metK等位基因导致MetK酶 部分功能丧失。氨基酸位置参照野生型MetK氨基酸序列，如图8A和SEQ ID NO :30所示。
[0110] 用于本发_方法的微牛物
[0111] 如本文和以举例的方式描述的，对大肠杆菌宿主细胞进行工程化，以使细菌产生 足以用于防止或减少重组蛋白质生产期间正亮氨酸错误掺入程度或范围的甲硫氨酸，包括 以高的宿主细胞密度进行的重组蛋白生产。因此，在本文提供的一些实施方案中，本发明提 供了突变的微生物菌株（即，突变的微生物宿主细胞），其产生甲硫氨酸至足以减少或防止 正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围（例如，至足以减少或防止正亮氨酸 错误掺入到重组蛋白或重组多肽的程度或范围，或至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入到 异源蛋白质或异源多肽的程度或范围）。
[0112] 适于在本方法的中使用的起始大肠杆菌宿主细胞包括，例如，（但不限于）大肠杆 菌W3110、大肠杆菌294、大肠杆菌X1776等。大肠杆菌宿主细胞的这些实例是说明性的而 不是限制性的。大肠杆菌菌株W3110是一个常见的用于重组DNA产物发酵的宿主菌株。任 何上述大肠杆菌宿主细胞株的突变的大肠杆菌宿主细胞也可以用作起始的宿主细胞，然后 进一步修饰以含有本文所述的突变的metA和/或metK等位基因。
[0113] 本发明表明，在重组蛋白质生产期间使用含有多种metA和metK突变的等位基因 和metA和metK突变的等位基因的组合的大肠杆菌宿主细胞，有效地防止正亮氨酸错误地 掺入到表达的重组蛋白质（见下实施例4)。
[0114] 本发明提供微生物，其中所述微生物产生甲硫氨酸至足以防止或减少正亮氨酸错 误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围。在一些方面中，本发明提供微生物，其中所述微 生物是反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物。在一些实施方案中，本发明提供了 包含突变的metA等位基因的微生物。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA 等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因编码MetA中的R27C氨基酸取代、MetA 中的Q64E氨基酸取代、MetA中的Y294C氨基酸取代、MetA中的I296S氨基酸取代、或MetA 中的P298L氨基酸取代。在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微 生物，所述突变的metA等位基因编码一种以上上述氨基酸取代，包括，例如，编码MetA中的 I296S氨基酸取代和P298L氨基酸取代的突变的metA等位基因。在多各方面中，包含任何一 种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物是细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。 本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生产异源（例如，重组）多肽和异源（例如 重组）蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
[0115] 如上所述，本发明提供包含一种或多种突变的metA等位基因的微生物。在一些实 施方案中，编码MetA中的R27C氨基酸取代、编码在MetA中的Q64E氨基酸取代、编码MetA 中的Y294C氨基酸取代、或编码MetA中的I296S氨基酸取代和P298L氨基酸取代的突变 的 metA 等位基因，分别被包含 SEQ ID NO:23(R27C)、SEQ ID NO:26(Q64E)、SEQ ID NO: 24(Y294C)或SEQ ID N0:25(I296S和P298L)的核酸序列编码。在其他实施方案中，由本发 明提供的微生物包含突变的metA等位基因，所述突变的metA等位基因由包含SEQ ID NO : 23(R27C)、SEQ ID N0:26(Q64E)、SEQ ID N0:24(Y294C)或 SEQ ID N0:25(I296S 和 P298L) 的核酸序列编码。在多个方面，包括任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物为 细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于 生产异源（例如，重组）多肽和异源（例如重组）蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮 氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
[0116] 如上所述，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸掺入到由微生物表达的蛋白质 和多肽中的方法，其中所述微生物是生产甲硫氨酸至足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到 蛋白质中或多肽中的程度或范围的微生物。在一些方面中，本发明提供微生物，其中，微生 物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方案中，本发明提供包含突变的metK等 位基因的微生物。在其他实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物，其 中所述突变的metK等位基因编码MetK中的V185E氨基酸取代。在一些实施方案中，本发 明提供包含突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metK等位基因包含在metK等 位基因的核酸残基1132上核酸胞嘧啶的缺失。在各个方面，包括任何一种或多种由本发明 提供的核酸序列的微生物为细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供 了本文中描述的微生物用于生产异源（例如，重组）多肽和异源（例如重组）蛋白质的用 途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
[0117] 如上所述，本发明提供包含一种或多种突变的metK等位基因的微生物。在一些实 施方案中，编码MetK中的V185E氨基酸取代或在metK等位基因的核酸残基1132上包含核 酸胞嘧啶缺失的突变的metK等位基因，分别由包含SEQ ID NO :27(V185E)的核酸序列或包 含SEQ ID N0:28(cll32del)的核酸序列编码。在其他实施方案中，由本发明提供的微生物 包含由包含SEQ ID N0:27(V185E)或SEQ ID N0:28(cll32del)的核酸序列编码的突变的 metK等位基因。在各方面中，包含任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物是细 菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生 产异源（例如，重组）多肽和异源（例如重组）蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨 酸错误地掺入到异源多肽中和异源蛋白质中。
[0118] 导致本文所述的氨基酸取代的任何编码metA或metK等位基因的核酸序列的用途 特别考虑用于本发明的方法中。
[0119] 在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因和突变的metK等位 基因的微生物。在一些实施方案中，由本发明提供的微生物是包含突变的metA等位基因和 突变的metK等位基因的微生物，其中突变的metA等位基因编码MetA中的Y294C氨基酸取 代，和突变的metK等位基因编码MetK中的V185E氨基酸取代。在由本发明提供的一些实施 方案中，微生物是包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物，其中所述突 变的metA等位基因编码MetA中的Y294C氨基酸取代，和突变的metK等位基因包含在metK 等位基因的核酸残基1132上核酸胞嘧啶的缺失。在各个方面，包括任何一种或多种由本发 明提供的核酸序列的微生物为细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提 供了本文中描述的任何微生物用于生产异源（例如，重组）多肽和异源（例如重组）蛋白 质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽中和异源蛋白质中。
[0120] 微牛物菌株的牛产
[0121] 本发明提供用于生产微生物（例如大肠杆菌的宿主细胞）的方法，其中，该微生物 产生甲硫氨酸至足以减少或防止正亮氨酸错误地掺入到多肽和蛋白质的程度或范围。以 举例的方式，使用如本领域已知的和先前所描述的等位基因交换方法生成包含突变的metA 等位基因和/或突变的metK等位基因的大肠杆菌宿主细胞（参见Metcalf等人，（1994) Genel38:l-7;和 Bass 等人，（1996)J Bacteriol 178:1154-61;参见本说明书的材料和方 法部分）。本发明并不限于产生包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的大肠 杆菌宿主细胞的方法。用于引入突变的等位基因的各种方法或以其他方式产生包含突变的 等位基因的微生物菌株（例如，细菌，大肠杆菌）的各种方法，对本领域技术人员是公知的。
[0122] 防Ih或减ΦιΗ亮氨酸的错误掺入
[0123] 本发明的方法和组合物可用于生产异源或重组蛋白质或多肽，并且可用于大规模 和小规模的蛋白质或多肽的生产。本发明的方法和组合物特别地对微生物高密度发酵是有 用的，例如，大肠杆菌宿主细胞用于生产重组蛋白质和多肽。由本发明提供的方法和组合物 对重组生产蛋白质和多肽是有用的，特别是用于其中正亮氨酸的错误掺入是不希望的重组 蛋白质和多肽生产中，例如，用于各种研宄和治疗应用的重组蛋白质和多肽中。
[0124] 在一些实施方案中，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物是反 馈抗性或反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物。在其他实施方案中，本发明提供 了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物 中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方 案中，反馈抗性或反馈不敏感的高丝氨酸琥?自酰转移酶的微生物是包含突变的metA等位 基因的微生物。在一些实施方案中，解除甲硫氨酸生产抑制的微生物是包含突变的metK等 位基因的微生物。在其他实施方案中，用于防止或减少正亮氨酸错误掺入的微生物包含突 变的metA等位基因和突变metK等位基因。
[0125] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变 的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含选自：SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、 SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26的核酸序列。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少 或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白 质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含 编码MetA的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自R27C、Q64E、Y294C、I296S和P298L的 MetA中的氨基酸取代。在其他实施方案中，所述核酸序列编码由I296S和P298L二者组成 的MetA中的氨基酸取代。氨基酸位置参照野生型MetA氨基酸序列，如图7A和SEQ ID NO: 29所示。
[0126] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变 的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO :27和SEQ ID NO: 28的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋 白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包 含突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK的核酸序列，其中 所述核酸序列编码MetK中的V185E氨基酸取代。在其他实施方案中，所述核酸序列包含在 metK等位基因的核酸残基位置1132上的胞嘧啶碱基缺失。氨基酸位置参照野生型MetK氨 基酸序列，如图8A和SEQ ID NO :30所示。
[0127] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物包含 突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，并且进一步地，其中所述突变的metA等位 基因包含SEQ ID NO :24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO :27的核酸序 列。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中或 多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突 变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO :24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO :28的核酸序列。
[0128] 在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中 或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变 的metA等位基因和metK等位基因，其中突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取 代Y294C的核酸序列，并且突变的metK等位基因包含编码MetK中氨