极端pcr的制作方法
【专利说明】极端PCR
[0001] 发明背景 聚合酶链式反应（PCR)是一种广泛用于分子生物学的技术。其名称来源于其关键成 分之一，一种通过体外酶促复制扩增一段DNA的DNA聚合酶。随着PCR进行，所产生的DNA (扩增子）本身用作复制的模板。这使链式反应处于运转中，其中DNA模板以指数扩增。随 着PCR，有可能扩增几个数量级的单拷贝或几个拷贝的一段DNA，产生数百万或更多拷贝的 DNA片段。PCR利用热稳定聚合酶、dNTP和一对引物。
[0002] PCR在概念上分成3个反应，每个反应通常假定在3种温度的每一种下随时间推移 而发生。根据每个循环在3种温度下在3个时段内发生的3个反应（变性、退火和延伸）， 容易理解PCR的这种"平衡范例"。然而，该平衡范例并不与物理现实良好契合。不会发生 瞬时温度变化；需要花时间改变样品温度。此外，各个反应速率随温度而变化，且一旦发生 引物退火，则聚合酶延伸紧随其后。特别对于快速PCR，更准确的是其中反应速率和温度总 在变化的动力学范例。在PCR期间保持温度恒定不是必需的，只要产物变性和引物退火。在 PCR的动力学范例下，产物变性、引物退火和聚合酶延伸可能短时重叠，并且其速率随温度 而不断变化。在平衡范例下，循环通过各持续一段时间的3种温度界定，而动力学范例需要 转缓变率和目标温度。图15a-15b显示了平衡和动力学范例的说明性时间/温度曲线图。 然而，要理解，这些温度曲线图只是说明性的，且在某些PCR实施中，退火和延伸步骤合并， 使得只需要2种温度。
[0003] 范例无对错，但它们在其实用性上不同。平衡范例易于理解，良好地付诸于工程理 念和仪器制造。动力学范例与生物化学、快速循环PCR和解链曲线分析更相关。
[0004] 当PCR在1980年代后期首次推广时，过程缓慢。一个典型方案是在94°C下变性1 分钟，在55°C下退火2分钟，在72°C下延伸3分钟。在包括用于温度间的转变的时间时，8 分钟循环是典型的，导致在4小时内完成30个循环。25%的循环时花费在温度转变上。当 循环速度提高时，花在温度转变上的时间的比例也提高，且动力学范例变得越来越相关。在 快速循环PCR期间，温度常常改变。对于短的产物（〈100 bp)的快速循环PCR，100%的时间 可能花在温度转变上，不需要保持时间。对于较长产物的快速循环PCR，可包括保持在最佳 延伸温度上的温度。
[0005] 孤立来看，术语"快速PCR"既是相关的，又是不明确的。与4小时相比，1小时PCR 是快速的，但与15分钟相比则是慢的。此外，如果以较高模板浓度开始或使用较少循环，则 可使PCR方案较短。一个更具体的度量是每个循环需要的时间。因此，"快速循环PCR"（或 "快速循环"）在1994年定义为在10-30分钟内完成30个循环（1)，导致各为20-60秒钟的 循环。每个循环的这个实际时间比通常针对变性、退火和延伸编程的时间总和长，因为需要 时间以使这些阶段每个之间的温度缓变。1990年代早期的初步研宄证实了使用用于温度控 制的毛细管和热气进行快速循环的可行性。多年来，系统变得更快，且变性、退火和延伸的 动力学要求变得更清楚。
[0006] 在一个早期快速系统中，发热元件和干发器的风扇、温差电偶和毛细管中的PCR 样品被封闭在一个室内（2)。风扇产生快速流动的热风通过温差电偶和毛细管。通过使温 差电偶的热反应与样品匹配，温差电偶的温度密切跟踪样品的温度，甚至在温度变化期间。 尽管空气具有低的导热性，但空气沿着由毛细管所暴露的大的表面积快速移动足以使样品 在变性、退火和延伸温度间循环。电子控制器监测温度，调节发热元件的功率，并提供循环 所需要的计时和次数。对于冷却，控制器激活螺线管，螺线管打开通向外部空气的入口，将 冷却空气引入否则密封的室中。
[0007] 使用毛细管/空气系统可快速改变温度。使用低热质量室、循环空气和玻璃毛细 管中的样品，仅在10分钟的PCR (30个循环，各20秒钟）后，就在溴化乙锭染色凝胶上观 察到>500 bp的PCR产物（3)。产物产量受延伸时间和聚合酶浓度的影响。以30秒钟循 环时间（对于延伸，在70和80°C间约10秒钟），随聚合酶浓度增强的谱带强度从0. 1单位 /10 μL反应物增加到0. 8单位/10 μL反应物。注意，聚合酶单位定义可能混乱。对于天然 Taq聚合酶，在典型的快速循环条件下，0.4 U/10 μL为约1.5 ηΜ (50)。
[0008] 在变性和退火温度下，快速方案利用瞬间或"0"秒钟保持。也就是说，温度-时间 曲线显示变性和退火的温度峰值，而不保持顶部和底部温度。变性和退火可非常快地发生。
[0009] 温度的快速和精确的控制允许分析研宄PCR所需要的温度和时间。对于人基因组 DNA的说明性536 bp片段（β -珠蛋白），介于91°C和97°C之间的变性温度是同样有效的， 变性时间从〈1秒钟到16秒钟同样如此。然而，发现长于16秒钟的变性时间实际上降低 产物产量。用50-60°C的退火温度获得呈良好产量的特定产物，只要限制引物退火的时间。 也就是说，通过从变性到退火的快速冷却和〈1秒钟的退火时间，获得最佳特异性。产量在 75-79°C的延伸温度下最佳，并且随至多约40秒钟的延伸时间而提高。
[0010] 从这项早期研宄到出的结论是：1) PCR产物的变性非常快，无需保持变性温度，2) 引物的退火可极快地发生，且退火温度保持可能不是必需的，和3)所需的延伸时间取决于 PCR产物长度和聚合酶浓度。此外，就特异性和产量而言，快速循环PCR不仅仅更快，而且更 好（4, 5)，只要精确控制温度。PCR速度不受可获得的生物化学的限制，但受无法严密或快 速控制样品温度的仪器的限制。
[0011] 然而，最新的实验室PCR仪器以瞬间的变性和退火时间而表现不佳，许多甚至不 允许"0"秒钟保持时间的编程。通过圆锥管壁的热传递的时间延迟、低的表面积-体积比率 和大样品的加热迫使大多数仪器在变性和退火时依靠时间延长以确保样品达到所需温度。 随着这些时间延迟，确切温度与时程变得不明确。结果是商品化产物内再现性有限且商品 化产物之间变化性高（6)。许多仪器显示在温度转变期间明显的温度改变（7,8)。温度的 下冲和/或过冲是一个惯常问题，试图通过取决于样品体积的软件预测难以解决。可随老 化而变化的仪器的热性质使所述困难复杂化。
[0012] 随时间推移，常规加热块仪器变得更快，具有"薄壁"管的改进增加、样品间更多传 导的热分布、低热质量块（mass block)和其它"快速"改进。然而，对于循环快到足以在少 于60秒钟内完成一个循环的这些系统是不常见的。很少加热块系统可达到〈60秒钟循环， 在有限的温度范围间通常限于2种温度循环。通过平整样品容器，快速循环可通过电阻加 热和空气冷却（9)，或通过移动保持在恒定温度下的加热区间柔性管中的样品（美国专利 号6, 706, 617)来实现。
[0013] 对于PCR自1991 (1)以来，而对于实时PCR自1996 (10,11)以来，可获得空气/ 毛细管系统的商品化形式。通常将其它仪器的快速循环能力与最早显示20-60秒钟循环的 空气/毛细管标准进行比较。最奇怪的是，多年来有将毛细管/空气系统运行得更慢的趋 势，或许反映了许多用户对"〇"秒钟变性和退火时间的不适。此外，热激活的酶需要长的激 活期，常常使运行时间加倍，甚至当使用"快速"活化酶时。另一种远离快速循环的折衷方 法是使用塑料毛细管。这些毛细管不与仪器热匹配，因此在变性和退火时通常需要20秒钟 保持以达到目标温度（12)。
[0014] 进一步减少PCR循环时间的某些进展发生在微系统中，其中自然处理小的体积 (13,14)。然而，即使用高表面积-体积比的样品室，如果发热元件具有高热质量并在室的 外部，循环也可能长（15)。随着薄膜电阻加热器和温度传感器接近样品，可现实10-30分钟 扩增（16,17)。
[0015] 虽然低热质量系统的冷却一般通过被动热扩散和/或通过强迫通风，但是开发了 数种有价值的加热方法。红外辐射可用于加热（18)，以标准化红外高温计用于温度监测 (19)。或者，玻璃毛细管上的薄金属膜可用作用于快速循环的电阻发热元件和温度传感器 两者（20)。最后，PCR溶液通过电解电阻的直接焦耳加热和温度监测是可能的，并且已在毛 细管中实施（21)。所有上述方法将热在固定样品间来回传递。
[0016] 可将样品以物理方法移动到不同的温度浴，或通过具有固定温度区的通道，作为 将热在静止样品间来回传递的替代。微型流体方法变得流行起来，其PCR流体通过保持在 变性、退火和延伸温度的不同节段在通道内通过。在经过3个温度区来回通过的蜿蜒通道 内（22)，并且在经过3个温度扇区的递增或递减半径的环路内（23)，已证实连续流PCR。 具有蜿蜒布局的变体使用静止热梯度而不是等温区，以更严密地契合PCR的动力学范例 (24)。为了限制PCR所必需的微通道的长度，一些系统通