在一个实施方案中，所述的方法使用了独立地编码Ku70或其功能片段、以及Ku80 或其功能片段的多核苷酸。在存在单一的多核苷酸序列的情况下，显然其编码2种蛋白质 /片段°
[0132] 在一个实施方案中，提供了本文所述的根据本发明公开的方法，其中编码Ku70、 Ku80、其组合或其功能片段的DNA序列以质粒形式提供。
[0133] 在一个实施方案中，在所述的方法中使用的质粒在上文中有所描述。
[0134] 在一个实施方案中，提供了一种方法，其中在步骤b)中，包含编码目的蛋白质的 DNA序列的表达盒以一个或多个质粒的形式提供。
[0135] 在一个实施方案中，提供了本文所述的方法，其中编码Ku70、Ku80、其组合或其功 能片段的多核苷酸瞬间转染至细胞中。
[0136] 在一个实施方案中，提供了本文所述的方法，其中在筛选或阳性选择缺失的情况 下，其中编码Ku70、Ku80、其组合或其功能片段的多核苷酸转染至细胞中。
[0137] 在一个实施方案中，提供了本文所述的方法，其中编码Ku70、Ku80、其组合或其功 能片段的多核苷酸例如在构成型或诱导型启动子的控制之下，例如诱导型启动子的控制之 下，未整合至宿主细胞基因组中。
[0138] 在一个实施方案中，提供了本文所述的方法，其中编码Ku70、Ku80、其组合或其功 能片段的多核苷酸例如在构成型或诱导型启动子的控制之下，例如诱导型启动子的控制之 下，稳定地转染至细胞（即，整合至宿主细胞基因组中）中。
[0139] 在一个实施方案中，提供了本文所述的方法，其中编码目的蛋白质的DNA序列稳 定地整合至细胞的基因组中。
[0140] 本发明的转染的宿主细胞可以在任何合适的培养基中培养，从而生产目的蛋白质 以及表达合适水平的所选蛋白质的克隆。
[0141] 如本文所用，在本文说明书中，术语"包含"可以解释为"包括"。
[0142] 实施方案和优选方案可以以技术上适当的方式组合。
[0143] 本发明公开描述了包含某些整数的实施方案。此外，本发明公开还扩展至由所述 的整数或基本上由所述的证实组成的一些实施方案。 实施例
[0144] 实施例是基于使用CH0K1或CH0-DG44细胞系的。在编码目的蛋白质（在本情况 下为MAb)的线性DNA存在下，使用编码在CMV启动子的控制之下的人类Ku70或Ku80的环 状DNA来瞬间转染所述的这些细胞，其中所述的线性DNA还包含选择标记物（在MAbl-4的 情况下，选择标记物为GS ;在MAb6-7的情况下，选择标记物为DHFR)。
[0145] 用于MAb 1的方法
[0146] 在编码目的蛋白质和GS选择标记物的线性DNA存在下，使用编码在CMV启动子的 控制之下的人类Ku70或Ku80的环状DNA来瞬间转染CH0K1细胞。
[0147] 转染的方法
[0148] 将lxlO7个细胞再次悬浮于600 y 1⑶-CH0培养物培养基中。
[0149] 将20 y g线性化的DNA(MAb+选择标记物）与20 y g空载体、或者20 y g Ku70或 Ku80或者10 y g Ku70和10 y g Ku80加入至细胞中，使得得到800 y 1的最终体积（表1)。
[0150]
【主权项】
1. 一种使用NHEJ蛋白质或其功能片段、或者编码它们的多核苷酸转染的宿主细胞，其 中所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下，并且所述的宿主细胞还被表达盒转 染，其中所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的多核苷酸（DNA或RNA)序列。
2. -种使用编码NHEJ蛋白质或其功能片段的多核苷酸序列转染的宿主细胞，其中所 述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下，并且所述的宿主细胞还被表达盒转染， 其中所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的多核苷酸序列。
3. -种根据权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞，其中所述的NHEJ蛋白质为Ku70 或Ku80,或者其功能片段。
4. 一种根据权利要求1至3的任意一项所述的宿主细胞，其被2种或更多种NHEJ蛋白 质或其功能片段、或者编码它们的一种或多种多核苷酸所转染。
5. -种根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞被Ku70和Ku80或其功 能片段、或者编码它们的一种或多种多核苷酸所转染。
6. -种根据权利要求1至5的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的细胞为原核细胞、 真核细胞或酵母菌。
7. -种根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为CHO细胞。
8. -种根据权利要求1至7的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的目的蛋白质为抗 体或其结合片段。
9. 一种根据权利要求1至8的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的目的蛋白质为导 致位点特异性突变的蛋白质，例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或其功能片段。
10. -种根据权利要求1至9的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的多核苷酸为 DNA0
11. 一种根据权利要求1至9的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的多核苷酸为 RNA0
12. -种根据权利要求1至11的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码NHEJ蛋白 质的多核苷酸序列为质粒形式。
13. -种根据权利要求1至12的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码目的蛋白 质的多核苷酸序列为质粒形式。
14. 一种根据权利要求1至12的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码目的蛋白 质的多核苷酸序列为线性DNA或RNA形式。
15. -种根据权利要求1至10、12和13的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码 目的蛋白质的DNA序列以质粒形式提供，并且其中所述的质粒进一步包含编码Ku70、Ku80、 Ku70和Ku80的组合或其功能片段的DNA序列。
16. -种根据权利要求1至15的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的启动子为强病 毒启动子。
17. -种根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述的启动子为CMV启动子。
18. -种根据权利要求1至17的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的NHEJ蛋白质或 其功能片段为人类、仓鼠、小鼠、酵母菌或其他序列来源。
19. 一种根据权利要求1至18的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码NHEJ蛋白 质或其功能片段的多核苷酸序列、和/或所述的包含编码目的蛋白质的DNA序列的表达盒 进一步包含选择标记物。
20. -种根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述的选择标记物为谷氨酰胺合成酶 标记物。
21. -种根据权利要求1至20的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的包含编码目的 蛋白质的DNA序列的表达盒稳定地整合至所述的细胞的基因组中。
22. -种根据权利要求1至21的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码NHEJ蛋白 质或其功能片段的多核苷酸序列瞬间转染至所述的细胞中。
23. -种根据权利要求1至22的任意一项所述的宿主细胞，其中所述的编码NHEJ蛋白 质或其功能片段的多核苷酸序列稳定地转染至所述的细胞中。
24. -种包含编码Ku70、Ku80、其组合或其功能片段的序列的质粒DNA，其中所述的DNA 序列处于合适的启动子的控制之下。
25. -种根据权利要求24所述的质粒DNA，其中所述的质粒进一步包含编码目的蛋白 质的DNA，例如其中所述的目的蛋白质为抗体或其结合片段。
26. -种根据权利要求24或25所述的质粒DNA，其中所述的DNA为环状的。
27. -种根据权利要求24或25所述的质粒DNA，其中所述的DNA为线性的。
28. -种生成宿主细胞的方法，其中所述的宿主细胞能够表达由多核苷酸序列编码的 目的蛋白质，所述的方法包括使用以下物质来转染所述的细胞的步骤： a. Ku70、Ku80、其组合或其功能片段，或者编码它们的一种或多种多核苷酸序列，其中 所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下；以及 b. 表达盒，其包含编码目的蛋白质的多核苷酸（DNA或RNA)序列。
29. -种根据权利要求28所述的方法，其中所述的在步骤a)和b)中的组成部分的转 染为共转染（伴随转染）。
30. -种根据权利要求28所述的方法，其中所述的在步骤a)中的组成部分的转染在所 述的步骤b)中的组成部分的转染之前进行。
31. -种根据权利要求28所述的方法，其中所述的在步骤b)中的组成部分的转染所述 的在步骤c)中的组成部分的转染之前进行。
32. -种根据权利要求28至31的任意一项所述的方法，其中在所述的步骤a)中，所述 的多核苷酸序列为编码Ku70、Ku80、其组合或其功能片段的DNA序列。
33. -种根据权利要求28至31的任意一项所述的方法，其中在所述的步骤a)中，所述 的多核苷酸序列为编码Ku70的DNA序列和编码Ku80的DNA序列。
34. -种根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述的多核苷酸序列是以质 粒形式提供的。
35. -种根据权利要求34所述的方法，其中所述的质粒在权利要求24至27中定义。
36. -种根据权利要求28至35的任意一项所述的方法，其中所述的包含编码目的蛋白 质的DNA序列的表达盒在质粒上提供。
37. -种根据权利要求28至36的任意一项所述的方法，其中所述的编码Ku70、Ku80、 其组合或其功能片段的多核苷酸序列瞬间转染至所述的细胞中。
38. -种根据权利要求28至36的任意一项所述的方法，其中所述的编码目的蛋白质的 DNA序列稳定地整合至所述的细胞的基因组中。
【专利摘要】本发明公开涉及使用NHEJ蛋白质或其功能片段、或者编码它们的多核苷酸转染的宿主细胞，其中所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下，并且所述的宿主细胞还被表达盒转染，所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的多核苷酸序列，本发明公开还涉及制备宿主细胞、质粒以及在制备宿主细胞和质粒过程中使用的中间体的方法，以及宿主细胞表达蛋白质的用途。
【IPC分类】C12N15-10, C12N15-63, C12N9-12
【公开号】CN104781405
【申请号】CN201380055655
【发明人】K·L·凯恩
【申请人】Ucb生物制药私人有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年9月30日
【公告号】CA2885517A1, EP2900824A1, US20150252385, WO2014049168A1