专利名称：氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨 基酸浓度的方法，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。
背景技术：
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测 定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析 仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、 或仪器设备成本较高等缺点。
氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基 酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来 说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸 含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基 酸氮)的百分率表示。 '
大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也 增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸 氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、R e y e综合征、或某些因素造成蛋 白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮 增加。
酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还
原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸诊 断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动 生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。
本发明氨基酸浓度测定方法原理如下
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+
过氧化氢
氨离子+ 2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶
L-谷氨酸+水+辅酶
这种方法应用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3)偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase ; EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3)酶促反应连续监测法/速率比色法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反 应产生氨离子，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nrn处没有吸收峰)，从而得以 测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处 吸光度下降的程度/速度，可以测算氨基酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试
剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
酮戊二酸酯 20 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L
本发明的氨基酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯。 试剂2
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1或
试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后
使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。
还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨基酸浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
酮戊二酸酯 20 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸 光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品 与试剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸 的浓度大小。 实施例二本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 还原型辅酶酮戊二酸酯50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氮基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8土0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品 与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸 的浓度大小。 实施例三本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶酮戊二酸酯10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂氨基酸氧化酶100mmol/L500 mmol/L10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用,测定氨基酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测氨基酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟 左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸浓度测定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+ 过氧化氢氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶L-谷氨酸+水+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。
2. -种氨基酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 酮戊二酸酯.20-500 mmol/L.1-4000 mmol/L.0.1-0.35 mmol/L.50 mmol/L.1000——80000 U/L.1000-.-80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 酮戊二酸酯组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脱氢酶组成。还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱 氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 酮戊二酸酯组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成； 试剂3，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶组成。还原型辅酶、酮戊 二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中 的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1—4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101324586SQ200710023360
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司