专利名称：氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸 浓度的方法，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。
技术背景氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项 目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分 光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备 成本较高等缺点。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸 (仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说， 多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量， 它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的 百分率表示。 .大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增 加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增 高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Re y e综合征、或某些因素造成蛋白质分 解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特 异性高、方法简便、成本低的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致 在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定氨基酸浓度的方法，同时， 本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅 可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且 测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明氨基酸浓度测定方法原理如下-
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶喷嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法应用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3) 偶联过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反应终点/速率比色法。氨 基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合过氧化物酶的 作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体 组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm(根 据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料一喷嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小；通过测 量400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度/ 速度，得出氨基酸浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 rmnol/L氨基酸氧化酶过氧化物酶还原型色原体组合10000U/L30000U/L0.1--20 mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3_甲基_2_苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻哇酮腙2,2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^"N' (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的氨基酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、氨基酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、氨基酸氧化酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂3
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、氨基酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、氨基酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
过氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 2 mmol/L
石碳酸 10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试主波 长505nm,测试副波长600mn，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓
度大小。
实施例二
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
10Ommol/L 0.2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L
氨基酸氧化酶
10000U/L
过氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试主波长 546nm，测试副波长600nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/20，反 应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分 钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。 实施例三本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L3-甲基-2-苯噻唑酮腙0.6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L双甲基苯胺2 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂氨基酸氧化E过氧化物酶500 mmol/L画00U/L30000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37T:，反应时间IO分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原 体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不 另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器 得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法技术的氨基酸浓度测定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+ 过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出氨基酸浓度大小测定结果。
2. —种氨基酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L氨基酸氧化酶 1000——80000 U/L过氧化物酶 500——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成 单剂试剂。4. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。 过氧化物酶、还原型色原体组合、氨基酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。5. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组 成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲 液、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、 过氧化物酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合氨基酸氧化酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。6. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、氨基酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出氨基酸浓度的大小。
文档编号C12Q1/00GK101324588SQ20071002336
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司