专利名称：氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒及氨基酸(氮)浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及 测定氨基酸(氮)浓度的方法，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定 技术领域。
技术背景氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测 定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析 仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、 或仪器设备成本较高等缺点。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨 基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境 中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的 氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮(氨基酸氮)的百分率表示。大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮 也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨 基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Re y e综合征、或某些因素 造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中 氮基酸氮增加。酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具 有特异性高、方法简便、成本低的特点。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法 (Enzymatic Recycling Method)、 酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺 辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸(氮) 浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸(氮)诊 断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行氨基酸(氮)浓度测定，而且测定速度快、准确度 高，因而可以得到切实的推广应用。本发明氨基酸(氮)浓度测定方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+过氧化氢氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢这种方法应用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3)酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、 甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)酶促反应连续监测法。 氨基酸氧化酶作为作用酶，功能为将氨基酸酶解产生氨离子。丙氨酸脱氢酶的第一个酶促作用使氨离子产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶 可以一再将丙氨酸再次变回氨离子，使氨离子不断地被重复循环利用。 丙氨酸脱氢酶又可作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰) 氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型 辅酶在340nm处吸光度下降的速度/速度，通过测量340nm处吸光度下 降的速度，可以测算氨基酸(氮)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸(氮) 诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L丙酮酸 1Ommol/L 氨基酸氧化酶 10000 U/L丙氨酸脱氢酶 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L本发明的氨基酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸 脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸。试剂2缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧 化酶。还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、。丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化 酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨基酸(氮)浓度的方法， 其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一本实施例的氨基酸(氮)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L丙酮酸 10 mmol/L氨基酸氧化酶 10000 U/L丙氨酸脱氢酶 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸(氮)的浓度大小。实施例二本实施例的氨基酸(氮)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂还原型辅酶丙酮酸50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L10000 U/L 10000U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸 光度1.8土0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样 品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反 应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨 基酸(氮)的浓度大小。 实施例三本实施例的氨基酸(氮)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L丙酮酸10 mmol/L试剂三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L500 mmol/L甘氨酸氧化酶10000 U/L 10000U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L试剂，可以直接使用。试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体测定氨基酸(氮)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37x:，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨 基酸(氮)的浓度大小。申请人经过实验验证，釆用以上发明内容中记载的其他各种还原型 色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸(氮)浓度测定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+过氧化氢氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出氨基酸(氮)的浓度大小测定结果。
2.一种氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20—500 mmol/L稳定剂1-4000 mmol/L还原型辅酶0.1-0.35 mmol/L丙酮酸1-50mmol/L氨基酸氧化酶1000-80000 U/L丙氨酸脱氢酶 1000-80000 U/L甘氨酸氧化酶1000-80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱 氢酶、甘氨酸氧化酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸 脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化 酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、氨 基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸 脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢 酶、甘氨酸氧化酶组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶 组成。还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨 酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，其特征在于-还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸(氮)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸(氮)的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101324585SQ200710023359
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司