专利名称：腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定 腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关 系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，
脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID),急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是
腺苷(白色结晶粉末)+水(H20 )腺苷脱氨酶肌苷(Inosine ) + 氨离子(NH/)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因 此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大 小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用 专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见 光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定， 而且测定速度快、准确度高，.因而可以得到切实的推广应用。本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根 腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+匚精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶N2-(D-l-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水 这种方法应用腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)酶(偶)联谷氨酰胺合成酶 (EC 6.3丄2)、丙酮酸羧化酶(EC 6.4丄1)、章鱼碱脱氢酶(EC 1.5丄11) 酶促反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷反应产生氨离子，再通过(偶)联合谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶的作用， 最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm 处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的 速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的 活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶 诊断试剂较为理想缓冲液100mmol/L稳定剂50 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L谷氨酰胺合成酶9000 U/L丙酮酸羧化酶8000 U/L章鱼碱脱氢酶12000U/L腺苷20 mmol/L谷氨酸20 mmol/L腺苷三磷酸12 mmol/L磷酸根40 mmol/L草酰乙酸10 mmol/L精氨酸20 mmol/L本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化 酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草 酰乙酸、精氨酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、 磷酸根、草酰乙酸、精氨酸。试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱 脱氢酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺 苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸。 试剂3缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱 脱氢酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺 苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸在试剂1、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定腺苷脱氨酶活性浓度的方 法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明,实施例一本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 还原型辅酶 谷氨酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶腺苷腺苷三磷酸 磷酸根50 mmol/L 0.25 mmol/L 9000 U/L 8000 U/L 12000U/L 20 mmol/L 20 mmol/L 12 mmol/L 40 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷 脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。实施例二本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷腺苷三磷酸磷酸根草酰乙酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L 12 mmol/L 40 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L试剂2(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L 50 mmol/L 9000 U/L 8000 U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始稳定剂谷氨酰胺合成l 丙酮酸羧化酶吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷 脱氨酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论 K值一2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱 氨酶的活性浓度大小。 实施例三本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L腺苷 20 mmol/L谷氨酸 20 mmol/L腺苷三磷酸 12mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L磷酸根 40 mmol/L草酰乙酸 10mmol/L精氨酸 20 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L谷氨酰胺合成酶 9000 U/L丙酮酸羧化酶 8000 U/L章鱼碱脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度 37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm， 测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的 体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约 l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱 氨酶的活性浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺 +腺苷二磷酸+磷酸根腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶 N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小结果。
2. —种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括: 缓冲液20-500 mmol/L稳定剂还原型辅酶谷氨酰胺合成酶丙酮酸羧化酶章鱼碱脱氢酶腺苷50 mmol/L0.1-0.35 mmol/L1000-20000 U/L1000-20000 U/L1000——30000 U/L100 mmol/L100 mmol/L腺苷三磷酸 1——50 mmol/L磷酸根 9——160mmol/L草酰乙酸 1——100 mmol/L精氨酸 1——100 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、 章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、 精氨酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、 章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸组成；试 剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼 碱脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章 鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精 氨酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、 章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷 酸根、草酰乙酸、精氨酸组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨 酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶组成。还原型辅酶、谷 氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺 苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸在试剂l、试剂2或试剂3 中的位置可以不限。 6.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、章鱼碱脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸根、草酰乙酸、精氨酸及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号C12Q1/26GK101324564SQ20071002323
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:沈丽华