专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无 机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态 平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反 之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升 血浆钙磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐 形式沉积在骨组织，>70时，可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将 妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软 骨病。血桨[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素 的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析 磷酸盐阴离子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原 法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动 注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验 室测定无机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多， 性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚 化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有 光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下 的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法 (Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成刚嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm波长处吸 光度的上升，得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实 现该方法的无机磷诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析 仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、灵 敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明无机磷浓度测定方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶n引嗒胺色原或醌亚胺色原+水 这种方法应用丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)酶(偶) 联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)、甘氨酸氧化酶 (glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7) 酶促反应速率比色法。丙酮酸羧化酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸 根)酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶的酶促作用使丙酮酸变成丙氨酸。甘 氨酸氧化酶作为循环酶将丙氨酸再次变回丙酮酸，使丙酮酸羧化酶酶解无 机磷产生的丙酮酸不断地被重复循环利用。同时甘氨酸氧化酶的作用也循 环不断地生成过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)作为显 色酶，通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的 染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原 体组合的不同而定)波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌 亚胺色原(Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大小速度，得出无机磷 浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L腺苷二磷酸5 mmol/L草酰乙酸30 mmol/L氨离子30 mmol/L丙酮酸羧化酶10000 U/L丙氨酸脱氢酶12000 U/L甘氨酸氧化酶12000 U/L过氧化物酶30000 U/L还原型色原体组合0.1-20 mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒]^-乙基^>1- G-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸 羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶。 还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化 酶、过氧化物酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。 还原型色原体组合、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶在试剂l、试 剂2或试剂3中的位置可以不P艮。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L腺苷二磷酸 5 mmol/L草酰乙酸30 mmol/L氨离子30 mmol/L丙酮酸羧化酶10000U/L丙氨酸脱氢酶12000U/L甘氨酸氧化酶12000U/L过氧化物酶30000 U/L4-氨基抗砒2 mmol/L石碳酸10 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试主 波长505nm，测试副波长600nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为 1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓 度大小。 实施例二本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L试剂2还原型辅酶 腺苷二磷酸 草酰乙酸 氨离子2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸羧化酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶 过氧化物酶0,25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L 0.2 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L10000U/L12000 U/L12000U/L30000 U/L4-氨基抗砒 0.6 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例三本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷二磷酸草酰乙酸.甲基-2-苯噻唑酮腙试剂2试剂三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶 过氧化物酶 双甲基苯胺三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L 0.6 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L12000 U/L12000U/L30000 U/L 2 mmol/L100 mmol/L500 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为 1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污 染。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出无机磷浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷二磷酸 1——50 mmol/L草酰乙酸 1——50mmol/L氨离子 1- 50mmol/L丙酮酸羧化酶 1000——80000 U/L丙氨酸脱氢酶 1000——80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000——80000 U/L过氧化物酶 500——80000 U/L还原型色原体组合 0.1——20mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型 色原体组合组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型 色原体组合组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、还原型色原体组合组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、 过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组 合、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、 丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂l,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、还原型色原体组合组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、还 原型色原体组合组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、 还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅 酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1-4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻哇酮腙 2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙<formula>formula see original document page 0</formula>N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-氨基抗砒 -4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出无机磷浓度的大小。
文档编号C12Q1/00GK101324620SQ200710023380
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司