用于免疫测定方法的缀合物的制作方法
【专利摘要】通过在涉及使用其上固定有抗体或抗原的胶态金属的免疫测定方法中的简单程序来根据待检测的对象调节检测灵敏度和扩大测量范围。利用两种组分，即生物来源的组分和非生物来源的组分对其上固定有抗体或抗原的胶态金属粒子的表面进行封闭处理能够利用例如所述两种组分的种类和浓度来调节测量灵敏度，并且能够使用所述非生物来源的组分，所述非生物来源的组分由于胶态金属的聚集还不是单独可用的。
【专利说明】用于免疫测定方法的缀合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于免疫测定方法如免疫层析法(下文中有时简称为1C)的缀合物(conjugate)，所述缀合物包含用抗体或抗原敏化的胶态金属。更具体地，本发明涉及用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭的缀合物。本发明还涉及各自使用所述缀合物的1C检测方法和用于免疫层析法的测试条，以及用于所述缀合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]用于免疫测定方法的充当缀合物(如标记的抗体)的组分的标记的一个实例是胶态金粒子(下文中有时简称为胶态金)，并且由所述胶态金粒子所致的显色使得能够确认测量结果。此外，基于显色的程度，还有可能定量检测样品中的待检测物质。
[0003]当将胶态金用作充当标记抗体的组分的标记时，胶态金的表面具有易于非特异性地吸附来源于样品的蛋白质和其他物质以及有意结合的抗体的性质。为了抑制这样的非特异性吸附，通常进行封闭处理，所述封闭处理涉及用含有牛血清清蛋白(BSA)、酪蛋白等作为活性组分的生物来源的封闭剂(下文中有时简称为生物来源的封闭剂)来涂覆胶态金没有被抗体结合的表面部分。含有非生物来源的组分作为活性组分的封闭剂(下文中有时简称为非生物来源的封闭剂)也可商购获得。然而，当本发明的发明人简单地用非生物来源的封闭剂替代生物来源的封闭剂和单独使用前者时，在封闭处理后缀合物自身发生聚集，并且因此不能够被再混悬，或者非生物来源的封闭剂趋于自然地聚集，并且因此例如其作为试剂的稳定性受损。因此，本发明的发明人未能够发现任何商购获得的非生物来源的封闭剂能够投入到实际应用中。
[0004]另一方面，在使用标记的抗体的定量免疫测定中，当待检测物质是多价抗原时，产生以下问题。由于抗原经由所述标记的抗体的相继交联，测量信号随着抗原浓度的增加而快速增加，并且因此在抗原浓度高的范围内观察不到取决于待检测物质的浓度的灵敏度的差异，这导致不能进行精确的定量。在此情况中，进行稀释样品的操作不是优选的，因为测量误差变得易于发生并且增加用于稀释操作的步骤使得该方法变得复杂。首先，预测哪个样品具有高的抗原浓度本身就不实际。
[0005]作为用于扩大其中待检测物质可以被测量的浓度范围的技术，例如，提供了描述在专利文献1中的技术。在专利文献1中，公开了这样的技术，所述技术涉及在用于免疫层析法的、包含通过在胶态金上固定抗体获得的标记抗体的测试条中，使用至少两种类型的具有不同粒度分布的胶态金粒子组的混合物作为缀合物。然而，由于所需的时间和成本，制备多种具有取决于待检测物质和目的的不同粒度分布的胶态金的混合物是不实际的。相关技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:JP2010_32396A
【发明内容】
[0008]发明要解决的问题
[0009]为了解决相关技术的问题，本发明要实现的一个目的是:在使用其上固定有抗体或抗原的胶态金属进行免疫测定的情况中，通过简单的方法，根据待检测的对象调节检测灵敏度和扩大测量范围，同时抑制在封闭处理后缀合物之间的聚集。另一个目的是在实现上述目的的同时防止杂质等在胶态金属表面的非特异性吸附。
[0010]解决问题的方式
[0011]本发明的发明人进行了广泛的研究以实现这样的目的，并且作为结果，已发现在其上固定有抗体的胶态金属粒子的表面的封闭中，组合地使用非生物来源的组分和生物来源的组分能够调节测量灵敏度和/或扩大测量范围。因此，本发明的发明人完成了本发明。即，尽管迄今由于当单独使用非生物来源的组分作为封闭剂时胶态金属发生聚集，还不可能使用非生物来源的组分作为封闭剂，本发明的发明人已首次发现其与生物来源的组分的组合使用不仅能够用作封闭剂而且还展现出新的效果，即，调节检测灵敏度和/或扩大测量范围。
[0012]具体地，本发明具有以下构成。
[0013]〈1> 一种缀合物，所述缀合物包含具有用抗体或抗原敏化的表面的胶态金属，其中所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
[0014]<2>根据构成〈1>所述的缀合物，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA;酪蛋白；丝胶蛋白(sericin);对应于作为大肠杆菌来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；NE0 PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
[0015]<3>根据构成〈1>或〈2>所述的缀合物，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯(methacrylic acidpolyoxyalkylene ester) ；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封闭缓冲液(无蛋白封闭缓冲液)。
[0016]<4>根据构成〈1>至〈3>中任一项所述的缀合物，其中甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:聚氧乙烯单甲基丙烯酸酯(polyoxyethylenemonomethacrylate);聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯(polyoxyethylenepolyoxytetramethylene monomethacrylate);聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯(polyoxyethylene polyoxypropylene monomethacrylate);和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙稀酸酉旨(octylpolyoxyethylene polyoxypropylene monomethacrylate)。
[0017]<5>根据构成〈1>至〈4>中任一项所述的缀合物，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
[0018]〈6>—种用于样品中的待检测物质的检测方法，所述检测方法包括使所述样品与包含具有用抗体或抗原敏化的表面的胶态金属的缀合物接触，所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
[0019]〈7>根据构成〈6>所述的检测方法，其中所述缀合物被携带(保持，carry)在用于免疫层析法的测试条上。
[0020]<8>根据构成〈6>或〈7>所述的检测方法，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA ;酪蛋白；丝胶蛋白；对应于作为大肠杆菌来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；NEO PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
[0021]<9>根据构成〈6>至〈8>中任一项所述的检测方法，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封闭缓冲液。
[0022]<10>根据构成〈6>至〈9>中任一项所述的检测方法，其中甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:聚氧乙烯单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯。
[0023]〈11>根据构成〈6>至〈10>中任一项所述的检测方法，其中所述待检测物质包括多价抗原。
[0024]<12>根据构成〈11>所述的检测方法，其中所述待检测物质包括D- 二聚体。
[0025]〈13>根据构成〈6>至〈12>中任一项所述的检测方法，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
[0026]〈14> 一种用于免疫层析法的测试条，其包括以下组分(组件，component):
[0027](1)缀合物垫(conjugate pad),所述缀合物垫携带缀合物,所述缀合物包含具有用第一抗体或抗原敏化的表面的胶态金属，所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭；和
[0028](2)不溶性膜(insoluble membrane),所述不溶性膜包含与所述缀合物和待检测物质的复合物结合的第二抗体，所述不溶性膜被设置在作为组分(1)的所述缀合物垫的下游。
[0029]<15>根据构成〈14>所述的测试条，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
[0030]<16>检测设备，其包括:根据构成〈14>或〈15>所述的用于免疫层析法的测试条；和外壳(housing)。
[0031]〈17> —种用于包含用抗体或抗原敏化的胶态金属的缀合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
[0032](a)用抗体或抗原敏化胶态金属以提供缀合物的步骤；
[0033](b)通过使所述缀合物与非生物来源的组分和生物来源的组分接触，从而对所述胶态金属的表面进行封闭处理的步骤；和
[0034](c)通过离心对经过所述封闭处理的所述缀合物进行浓缩的步骤。
[0035]<18>根据构成<17〉所述的缀合物的制备方法，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA;酪蛋白；丝胶蛋白；对应于作为大肠杆菌来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；ΝΕ0 PROTEINSAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
[0036]<19>根据构成<17〉或〈18>所述的缀合物的制备方法，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封闭缓冲液。
[0037]<20>根据构成<17〉所述的制备方法，其中所述步骤(b)包括以下步骤:通过使所述缀合物与所述非生物来源的组分接触，然后使所述缀合物与所述生物来源的组分接触，从而对所述胶态金属的表面进行所述封闭处理。
[0038]<21>根据构成<17〉至〈20>中任一项所述的制备方法，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
[0039]发明效果
[0040]在涉及使用包含在其上固定有抗体或抗原的胶态金属的缀合物的免疫测定方法中，尽管迄今将非生物来源的封闭剂单独用于封闭已引起胶态金属粒子之间的聚集，并且所得物不能用作缀合物，而通过用生物来源的组分和非生物来源的组分封闭胶态金属粒子的表面能够实现用作所述缀合物。此外，用生物来源的组分和非生物来源的组分两者来封闭胶态金属粒子的表面使得能够根据待检测对象来调节灵敏度或扩大测量范围。此外，用生物来源的组分和非生物来源的组分两者来封闭胶态金属粒子的表面能够使用于浓度校准的参比物质和样品中的待检测物质的反应行为彼此相同，以及能够改善定量和与参比测量方法的相关性。
[0041]根据上述效果的实现，例如，可以通用地设计测试条以致适于检测器的检测性能，并且有利于利用一个样品和一个测试条同时检测处于不同浓度区的两种以上待检测物质。此外，可以通过比以往更简单的操作制备所需的缀合物，这导致良好的经济效率。本发明还可以满足即时(point-of-care) (P0C)检验领域中的多种需要。
[0042]附图简述
[0043]图1是本发明的测试条的示意结构图。
[0044]图2是曲线图，其显示在利用根据本发明的各种制剂和单独的BSA制剂封闭胶态金的情况中取决于抗原浓度的测量灵敏度的比较。
[0045]图3是曲线图，其显示在利用根据本发明的各种制剂和单独的BPF制剂封闭胶态金的情况中取决于抗原浓度的测量灵敏度的比较。
[0046]图4是曲线图，其显示对封闭剂添加次序的研究的结果。
[0047]图5是曲线图，其显示对不同封闭剂的可用浓度范围的研究的结果。
【具体实施方式】
[0048](缀合物)
[0049]本发明的缀合物包含用(已固定在其上)特异性结合样品中的待检测物质的物质如抗体或抗原敏化的胶态金属，所述缀合物的特征在于所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
[0050]本发明的缀合物可以用于基于固定在粒子表面上的抗体或抗原和样品中的待检测物质之间的抗原-抗体反应的测量方法，如1C法或比浊免疫测定法(TIA法)。在以下描述中，以其中抗体被固定在膜上的1C法为例。本领域技术人员可以容易地理解，当待检测物质是抗体时，其足以将能够捕获该抗体的物质(针对充当待测对象的抗体的抗原或抗体)固定在胶态金属或不溶性膜上。在以下描述中，以其中特异性结合样品中的待测物质的物质是抗体或抗原的情形为例。
[0051](胶态金属)
[0052]用于本发明的胶态金属可以是任何胶态金属，只要该胶态金属可以通过用抗体或抗原敏化来构建缀合物，并且可以通过与样品接触而在用于样品中的待检测物质(抗原或抗体)的检测方法中起作为标记的作用。
[0053]所述胶态金属可以是，例如，胶态金，胶态钼，胶态银，胶态钮，胶态铜，胶态镍，胶态铟，或它们的复合胶体。这之中，胶态金或胶态钼是合适的。此外，当在本文中提及时，胶态金属还涵盖具有用金属加工过的表面的细粒子，如其中非金属粒子如乳胶粒子或二氧化娃粒子充当核心粒子而其表面涂覆有金的细粒子。
[0054]下文中，通过以胶态金作为胶态金属的典型实例来描述本发明。已知胶态金的粒径极大地影响检测灵敏度。例如，当缀合物通过被携带在用于免疫层析法的测试条上使用时，胶态金的粒径优选为20至60nm,更优选为30至50nm,尤其优选为30nm。胶态金可以通过通常已知的方法制备，所述方法涉及例如在搅拌下向四氯金(III)酸的加热的水溶液中逐滴加入柠檬酸三钠的水溶液或柠檬酸三铵的水溶液。胶态金在本文中有时被称为胶态金粒子，并且这些术语具有相同的含义。
[0055](抗体或抗原在胶态金上的固定)
[0056]针对待测对象的抗体或抗原在胶态金上的固定通常通过在由所述胶态金与所述抗体或抗原混合所获得的溶液中的物理吸附进行。当作为实例描述抗体的固定时，抗体的浓度优选被调节至1 μ g/mL至5 μ g/mL,并且缓冲液及其pH优选为10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6 至 7)或 10mmol/LTris-HCl 缓冲液(pH7 至 9)，更优选为 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.5)，但是不限于此，包括使用其他缓冲液。本文中，不仅是如上所述的其上固定有针对待测对象的抗体或抗原的胶态金，而且在其上固定有对照抗体的胶态金也被称为"缀合物"。
[0057](封闭)
[0058]本发明的缀合物的特征在于胶态金表面中没有结合抗体的区域用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
[0059]迄今，对于胶态金的封闭，通常单独使用生物来源的蛋白质如BSA、酪蛋白或明胶，并且非生物来源的封闭剂如用于其他载体如乳胶粒子的非生物来源的封闭剂还未被用于胶态金。这是因为将非生物来源的封闭剂用于封闭胶态金可能导致胶态金的非特异性聚集。在这样的情况下，本发明的发明人使用非生物来源的组分和生物来源的组分作为用于胶态金的封闭剂，以利用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭胶态金的表面，并且因此成功地调节了检测灵敏度并扩大了测量范围。
[0060]S卩，根据待测对象的所需测量可以通过以下方式来进行:预先研究用于每个待测对象的非生物来源的组分和生物来源的组分的每种组合的测量灵敏度和测量范围，并且根据目的选择组合。
[0061]应当注意的是，在本文中，"调节检测灵敏度"是指:与通过一般技术在特定测量系统中测量具有特定浓度的待测物质的情况相比，增大或减小测量值。此外，"扩大测量范围"是指:与常规方法相比，在低浓度或高浓度区中以浓度依赖性方式扩大其中可以测量样品中的待测物质的范围。
[0062]不希望受制于任何具体理论，可想到的是，在吸附到胶态金属的表面上方面，生物来源的组分和非生物来源的组分具有不同的趋势，并且因此处于这样的关系使得两种组分相互填补空白。此外，还预期，吸附在表面上的两种组分控制例如固定在金属表面上的抗体和各种非特异性吸附的物质之间的三维关系。据估计，这些机制中的一个或多个起作用使得能够根据相应组分的组合调节检测灵敏度和扩大测量范围。
[0063](非生物来源的组分)
[0064]用于本发明的封闭的非生物来源的组分可以是任何组分，只要该组分不来源于有机体并且具有封闭作用。其实例是甲基丙烯酸聚氧化烯酯。其具体实例包括:合成的聚合物如聚氧乙烯单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯。其更具体的实例包括可商购获得的封闭剂如N101 (含有聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯作为主要组分)；N102(含有聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯作为主要组分)；SN100(都是由NOF CORPORATION生产)；NB4025 (由 COSMO BIO C0.，LTD.生产)；Stabil Guard (由 SurModics Inc.生产)；和 Protein-Free 封闭缓冲液(由 Thermo Fisher Scientific Inc.生产)。这之中，ΝΙΟΙ、Ν102和ΝΒ4025是优选的。
[0065]除了以上实例以外，可以用于本发明的非生物来源的封闭剂可以通过在后面描述的试验例1和试验例2中所述的试验方法进行选择。
[0066]使用的非生物来源的组分的浓度仅需要根据要使用的组分来适当地确定。例如，封闭可以通过以下方式进行:在调节至10D/mL的胶态金溶液中添加和混合抗体溶液，然后向该混合溶液中加入上述商购获得的产品以具有0.1至15%的终浓度(当未稀释的封闭剂被定义为100%时)。此外，该终浓度的下限不限于0.1%，以致可以选择任何浓度如0.2、0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1 %作为终浓度的下限。此外，该终浓度的上限不限于15%,以致可以选择任何浓度如14、13、12、11或10%作为终浓度的上限。此外，它们的组合例如是上述上限和下限的任意组合，如0.2至14,0.3 Μ 13、0.4至12、0.5至11、0.6至10,0.7至9、0.8至8、0.9至7或1至6%。这之中，可以优选使用0.5至10%的终浓度。
[0067]非生物来源的组分可以通过化学合成获得，并且可以通过根据其结构的合适量化方法进行量化，如在甲基丙烯酸聚氧化烯酯的情况中通过滴定来源于甲基丙烯酸的羧基的量化，通过NMR对乙烯基的量化，或基于通过MS或GPC的分子量测量的量化。
[0068](生物来源的组分)
[0069]用于本发明的封闭的生物来源的组分可以是任何组分，只要该组分来源于有机体并且具有封闭作用。其实例包括:动物或植物蛋白质；和来源于动物或植物蛋白质的肽。其具体实例包括:BSA,其表示牛血清白蛋白；酪蛋白；Blocking Peptide Fragment (封闭肽片段，BPF:由Τ0Υ0Β0生产)，其是对应于DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽，DnaK是大肠杆菌(Escherichia coli)来源的热休克蛋白(HSP);丝蛋白来源的ΝΕ0PROTEIN SAVER(由Τ0Υ0Β0生产)(丝胶蛋白的水解产物);StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液(由 PIERCE 生产);和 Stabil Coat (由 SurModics, Inc.生产)。
[0070]生物来源的组分的浓度仅需要根据要使用的组分来适当地确定。例如，封闭可以通过以下方式进行:在调节至10D/mL的胶态金溶液中添加和混合抗体溶液，然后向该混合溶液中加入生物来源的组分以具有0.1至10%的终浓度。此外，该终浓度的下限不限于0.1%，以致可以选择任何浓度如0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1%作为终浓度的下限。此外，该终浓度的上限不限于10%，以致可以选择任何浓度如9、8、7、6、5、4、3或2%作为终浓度的上限。此外，它们的组合例如是上述上限和下限的任意组合，如0.2至9、0.3至8、0.4至7、0.5至6、0.6至5、0.7至4、0.8至3、0.9至2或1至1.5%。这之中，可以优选使用0.5至5%的终浓度。
[0071](封闭方法)
[0072]作为用两种组分，S卩，非生物来源的组分和生物来源的组分来封闭胶态金表面中没有结合抗体的区域的方法，包含在本发明范围内的不仅有涉及单独地制备非生物来源的组分和生物来源的组分的混合物，以及将所述混合物与缀合物混合以立即进行封闭的方法，而且还有涉及将任一组分与缀合物混合，然后将所得物与另一组分混合从而用两个阶段进行封闭的方法。
[0073]前一种方法的实例通过例如以下步骤(1)至(3)进行:
[0074](1)用抗体敏化胶态金以提供缀合物的步骤；
[0075](2)将非生物来源的组分和生物来源的组分混合以提供混合物的步骤；和
[0076](3)通过将所述混合物与缀合物混合而对胶态金的表面进行封闭处理的步骤。
[0077]此外，后一种方法的实例通过例如以下步骤㈧至(C)或(a)至(c)进行:
[0078](A)用抗体敏化胶态金以提供缀合物；
[0079](B)通过将非生物来源的组分与缀合物混合而对胶态金的表面进行第一次封闭处理；和
[0080](C)通过将生物来源的组分添加到步骤(B)中的第一封闭处理的产物中而对胶态金的表面进行第二次封闭处理；
[0081]或者
[0082](a)用抗体敏化胶态金以提供缀合物；
[0083](b)通过将生物来源的组分与缀合物混合而对胶态金的表面进行第一次封闭处理；和
[0084](c)通过将非生物来源的组分添加到步骤(B)中的第一封闭处理的产物中而对胶态金的表面进行第二次封闭处理。
[0085](检测试剂)
[0086]在本发明中，术语"检测试剂"具体是指至少含有缀合物的溶液。
[0087]检测试剂可以包含，例如，稳定剂、溶解助剂等中的一种或多种用于将缀合物保持在稳态并且当缀合物与样品混合时促进固定在缀合物上的抗体与待测对象的特异性反应，或者快速且有效地使缀合物溶解或流化的目的。稳定剂、溶解助剂等的实例可以包括牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、酪蛋白和氨基酸。
[0088]此外，检测试剂可以包含如用于提高检测灵敏度目的所需的已知的敏化剂，如2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖或聚乙烯醇。
[0089]此外，检测试剂可以根据需要包含用于Ca2+离子等的金属螯合剂，如EDTA或EGTA。
[0090]应当注意的是，当在本文中使用时，术语"检测"或"测量"应当以最宽泛含义解释，包括，例如，证明待测对象的存在和/或定量，并且不应当以任何限制性的方式解释。
[0091](用于本发明的抗体)
[0092]用于本发明的针对待检测物质的抗体仅需要是与待检测物质特异性反应的抗体，并且在其制备方法方面绝不受限制。此外，所述抗体可以是多克隆抗体或可以是单克隆抗体。通常，制备抗体的杂交瘤可以通过以下方式产生:依照Kohler和Milstein的方法(参见Nature，Volume256，p495 (1975))，对用作为待测物质的抗原免疫化的动物的脾细胞和相同物种的骨髓瘤细胞进行细胞融合。备选地，单克隆抗体可以通过DNA免疫化法制备，并且可以参考Naturel992Marl2 ;356 152-154 或 J.1mmunol.Methods Mar 1 ；249 147-154来制备。
[0093]作为用于本发明的抗体，代替如上所述的通过免疫化动物的步骤获得的抗体或通过DNA免疫化方法获得的抗体，可以使用通过利用遗传重组技术获得的抗体(例如，嵌合抗体)，并且代替抗体的整个分子，可以使用具有抗原-抗体反应活性的抗体的功能片段。抗体的功能片段的实例包括F(ab' )2和？&13'，并且这些功能片段可以通过用蛋白酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上所述获得的抗体来制备。
[0094]在本文中，当所用的抗体是单克隆抗体时，在其中用于缀合物的抗体(第一抗体)的表位是一价的情况中，与该第一抗体的表位不同的表位被用作固定在不溶性膜上的抗体(第二抗体)的表位，并且在其中第一抗体的表位是多价的情况中，第二抗体可以是具有与第一抗体的表位相同的表位的抗体，或者第一抗体和第二抗体可以是相同的抗体。
[0095]在后面要描述的实施例中使用抗-D-二聚体单克隆抗体。用于本发明的抗-D-二聚体单克隆抗体的制备方法如下一节中所述，但是本发明不限于此，并且可以使用商购获得的抗-D- 二聚体单克隆抗体。商购获得的抗-D- 二聚体单克隆抗体的实例包括:Hytest Ltd.的克隆#DD1 至#DD6 ;和 Fitzgerald Industries International, Inc 的克隆#M01102704ο此外，可以使用由American Diagnostica Inc.生产的克隆#DD3B6。应当注意的是，为了方便，由克隆产生的抗体在本文中有时通过克隆编号或符号表示(克隆#编号或符号)。
[0096](抗-D-二聚体单克隆抗体的制备例)
[0097](1)杂交瘤的制备
[0098]将通过对溶解在PBS中的纯化的人纤维蛋白原进行巴曲酶(batroxobin)处理产生的可溶性纤维蛋白用作免疫原。该免疫原与弗氏完全佐剂(由GIBC0生产)以1: 1混合并乳化，并且将0.lmg/0.lmL的所得物(乳液)皮下施用至6周龄雌性BALB/C小鼠，6次，以1周为间隔。然后，在最终免疫后3天，收获脾。将获自所收获的脾的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Agl4以6: 1的比率混合，并且在50%聚乙二醇1540(由Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.生产)存在下进行细胞融合。将融合的细胞以2.5X 106/mL悬浮在HAT培养基中作为脾细胞，并且将悬浮液以0.2mL/孔分配到96孔培养板(由CORNING生产)的孔中。将所述板在5% C02培养箱中在37°C温育，并且在约2周后，通过ELISA方法对其中生长有杂交瘤的孔中的培养物上清液进行产生对DD级分有反应性的抗体的细胞株的选择。具体地，经由山羊抗-小鼠IgG(Fc)抗体(由JACKSON生产)将每个培养物上清液中的IgG在微板(由NUNC生产)上成固相，然后与DD级分反应。此外，使所得物与过氧化物酶标记的抗-纤维蛋白原兔多克隆抗体(由DAK0生产)反应。之后，加入含有邻苯二胺(由Tokyo Chemical Industry C0.,Ltd.生产)的过氧化物酶底物溶液以显色，并且加入1.5N硫酸以终止显色。之后，利用微板读数器进行测量(Abs.492nm)，并且选择对DD级分显示高反应性的细胞珠。通过有限稀释方法克隆杂交瘤以建立两种产生抗-D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤。
[0099](2)单克隆抗体的制备
[0100]向2周前已经腹膜内注射0.5mL的姥鲛烷(pristane)的12周龄雌性BALB/C小鼠，以0.5X 106个细胞的量腹膜内施用以上(1)中获得的杂交瘤。约2周后，收集腹水并离心以得到上清液。将该上清液与等量的用于吸附的缓冲液(3mol/L NaCl-1.5mol/L甘氨酸-NaOH，pH8.5)混合,然后过滤该混合物。使滤液通过用用于吸附的缓冲液平衡的蛋白质A柱(由Pharmacia生产)以将抗体吸附到所述柱上，然后用0.lmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)将抗体从柱上洗脱从而纯化抗-D-二聚体单克隆抗体(克隆#672102和克隆#672101)。
[0101](样品垫)
[0102]在本发明中，"样品垫"是用于接收测量样品的部分(part)，并且涵盖当模塑成垫时可以吸收液体测量样品并且允许该液体和待测对象的组分通过的任何材料和形状的垫。适于样品垫的材料的具体实例包括，但不限于，玻璃纤维，丙烯酸纤维，亲水聚乙烯材料，干纸，纸浆和织物。合适地使用由玻璃纤维制成的垫。样品垫也可以充当后面将描述的缀合物垫。此外，根据需要，通常使用的封闭试剂可以结合到样品垫中，只要该结合不背离本发明的目的并且不影响反应系统。
[0103](缀合物垫)
[0104]在本发明中，"缀合物垫"通过以下方式获得:用与待检测物质特异性反应的检测试剂浸溃适于之后将描述的缀合物垫的材料，之后干燥。缀合物垫具有这样的功能，即当测量样品通过缀合物垫时，允许缀合物和待检测物质形成复合物。缀合物垫可以单独设置成与固定抗-待测物质抗体的膜接触。备选地，缀合物垫可以设置成与样品垫接触以致缀合物垫可以接收通过毛细流动已经通过样品垫的样品并随后通过毛细流动将样品转移到另一个垫(下文中被称为"第3垫")，以此使缀合物垫在与接触样品垫的表面不同的表面处进行接触。应当注意的是，可以适当地改变对用于样品垫和缀合物垫中的一种或多种的部分的选择，以及如何将所选的部分设置在固定抗体的膜上。
[0105]适于缀合物垫的材料例如，但不限于，纸，纤维素混合物，硝化纤维素，聚酯，丙烯腈共聚物，玻璃纤维，或无纺纤维如人造纤维。合适地使用由玻璃纤维制成的垫。
[0106]当需要时，缀合物垫可以包含用于保护免疫层析法的可靠性的"对照试剂"，如不与样品的组分反应的标记的抗体，或标记的高抗原性蛋白如钥孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin) (KLH)。这些对照试剂是不可能存在于样品中的组分(物质)，并且可以被适当地选择。
[0107](第3垫)
[0108]在本发明中，可以设置第3垫以用于从样品的组分中除去对于待检测物质的检测以及检测试剂不必要的组分，以允许对于固定抗体的膜中的反应必要的组分的平稳前进。例如，理想的是除去作为对于检测不必要的组分的血细胞、不溶的被破坏的血细胞等。此夕卜，所述第3垫还可以具有以下额外效果:从由抗原-抗体反应产生的聚集体中预先除去变得太大而不能移动至并且在固定抗体的膜中平稳前进的聚集体除去。所述第3垫涵盖所述液体和待测对象的组分可以通过的任何材料和形状的垫。其具体实例包括，但不限于，玻璃纤维，丙烯酸纤维，亲水聚乙烯材料，干纸，纸浆和织物。合适地使用血细胞分离膜或类似的膜。
[0109](抗体在不溶性膜上的固定)
[0110]在本发明的1C试剂中的针对待检测物质的抗体在不溶性膜上的固定可以通过已知方法进行。例如，在流动通过(flow-through)形式的情况中，所述抗体被制备成具有预定浓度的溶液，并且将一定量的该溶液以特定符号如点或+的形状施加到不溶性膜上。此夕卜，在此情况中，为了保证免疫层析法的可靠性，能够结合缀合物的蛋白质或化合物通常被固定在与针对待测对象的抗体的位置不同的位置处以充当"对照线"。此外，针对对照试剂的抗体可以被固定在与针对待测对象的抗体的位置不同的位置处以充当"对照线"。
[0111]在横向流动(lateral-flow)形式的情况中，固定如下进行:将抗体制备成具有预定浓度的溶液，并且通过使用例如具有能够水平移动喷嘴同时以恒定速率将溶液从喷嘴释放的机构的设备，将所述溶液以线形状施加到不溶性膜上。在此情况中，抗体的浓度优选为
0.lmg/mL至5mg/mL,更合适地为0.5mg/mL至2mg/mL。此夕卜，固定在不溶性膜上的抗体的量可以通过调节滴加在不溶性膜上的溶液的量(在流动通过形式的情况中)来优化，并且可以通过调节溶液自设备喷嘴的释放速率(在横向流动形式的情况中)来优化。特别地，在横向流动形式的情况中，所述量合适地为0.5 μ L/cm至2 μ L/cm。应当注意的是，在本发明中，术语"流动通过形式膜测定"是指这样的形式，其中样品液体等前进以垂直地通过不溶性膜，而术语"横向流动形式膜测定"是指这样的形式，其中样品液体等前进以与不溶性膜平行地移动。
[0112]此外，在本发明中，关于针对待检测物质的抗体在不溶性膜中施加的位置，在横向流动形式的情况中，该位置仅需这样设置成使样品液体可以通过毛细作用从缀合物垫前进，并且相继通过其中针对待检测物质的抗体和对照抗体分别施加的线。所述位置优选设置成其中施加针对待检测物质的抗体的线可以位于其上游，而其中施加对照抗体的线可以位于其下游。在此情况中，各个线之间的距离理想地被设置成足以允许检测来自标记的信号。而且在流动通过形式的情况中，施加针对待检测物质的抗体的位置仅需要设置成允许检测来自标记的信号。
[0113]要施加到不溶性膜上的抗体溶液通常可以通过使用预定的缓冲液来制备。缓冲液的种类可以是例如常用的缓冲液如磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液或GoocT s缓冲液。缓冲液的PH，优选落在6.0至9.5的范围内，仅需要根据所用的抗体的性质适当地设定。例如，pH为9.0的缓冲液可以用于后面将要描述的抗-D- 二聚体单克隆抗体。缓冲液还可以含有，例如，盐如NaCl,稳定剂或防腐剂如鹿糖，或杀菌剂如ProClin。所述盐包括添加用于调节离子强度的盐，如NaCl，以及在调节缓冲液pH的步骤中添加的盐，如氢氧化钠。在将抗体固定在不溶性膜上后，可以通过将常用封闭剂变成溶液或蒸汽态并且用所述封闭剂涂覆除固定有抗体的部分以外的部分来进一步进行封闭。如上所述的其上固定有抗体的不溶性膜在本文中有时被称为"固定抗体的膜"。
[0114](不溶性膜)
[0115]在本发明中，作为不溶性膜(下文中有时简称为膜)，可以使用由任何材料制成的膜。其实例包括，但不限于，聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，尼龙，玻璃纤维，多糖如纤维素和纤维素衍生物，以及陶瓷。其具体实例可以包括由Millipore,Toyo Roshi Kaisha,Ltd.、Whatman等销售的玻璃纤维滤纸，纤维素滤纸等。此外，通过适当地选择不溶性膜的孔径和结构，可以控制胶态金-标记的抗体和待检测物质的免疫复合物在膜中流动的速率。通过控制在膜中的流速，可以调节要与固定在膜上的抗体结合的标记的抗体的量。因此，考虑其与用于本发明的免疫层析法的测试条的其他组成材料的组合来理想地优化膜的孔径和结构。
[0116](吸收垫)
[0117]在本发明中，吸收垫是具有液体吸收性以通过吸收已经移动到不溶性膜中或已经通过不溶性膜的测量样品来控制测量样品的前进的部分。在横向流动形式中，吸收垫仅需要被设置在条结构的最下游部分，而在流动通过形式中，其仅需要被设置在例如固定有抗体的膜的下游。例如，滤纸可以被用作吸收垫，而吸收垫不限于此。合适地使用Whatman的740-E 等。
[0118](用于免疫层析法的测试条)
[0119]本发明的用于免疫层析法的测试条至少包括以下组分:
[0120](1)缀合物垫，所述缀合物垫携带缀合物，所述缀合物包含胶态金，所述胶态金具有用第一抗体敏化的表面，所述胶态金的表面用两种组分，即，非生物来源的组分和生物来源的组分封闭；和
[0121](2)不溶性膜，所述不溶性膜包含与缀合物和待检测物质的复合物结合的第二抗体，所述不溶性膜被设置在缀合物垫的下游。除了上述构造以外，用于免疫层析法的测试条还涵盖其上还设置和安装有样品垫、吸收垫和第3垫中的任一个或多个的构造。测试条的组分通常被布置在固相支持物如塑料压敏粘合剂板上。明显的是，不仅固相支持物用不妨碍测量样品的毛细流动的物质构建，而且将不妨碍测量样品的毛细流动的物质被用作粘合剂组分。应当注意的是，聚酯膜等可以用于层压用于增强固定有抗体的膜的机械强度并防止测定期间的水蒸发(干燥)的目的。
[0122](检测装置)
[0123]本发明的用于免疫层析法的测试条可以通过将其封装/安装在考虑例如，条的尺寸，添加测量样品的方法和添加测量样品的位置，固定有抗体的膜中固定抗体的位置，和用于信号的检测方法而设计的合适容器(外壳)中来使用，并且处于这样的封装/安装状态的测试条被称为"装置"。
[0124](其他)
[0125]本文中，"不溶性膜"有时被称为"固相"，并且物理或化学地将抗原或抗体负载在不溶性膜上的行为或这样负载的抗原或抗体的状态有时用术语"固定"、"固定化"、"固相"、"敏化"、"吸附"或"携带"来描述。
[0126](样品)
[0127]在本发明的检测方法中，含有待检测物质的"样品"可以例如是，但不限于，血液，血清，血浆，尿液，唾液，痰，胰腺提取物，泪液，耳液溢(otorrhea)，和前列腺液。通常，全血、血清或血浆是优选的。术语"样本"在本文中以与"样品"相同的含义使用。
[0128](待测对象)
[0129]本发明的待测对象是存在于血液，血清，血浆，尿液，唾液，痰，胰腺提取物，泪液，耳液溢，前列腺液等中的物质。其实例包括:炎症相关标记物如C-反应性蛋白(CRP)，IgA，IgG,和IgM ;凝血和纤维蛋白溶解标记物如纤维蛋白降解产物(例如，D- 二聚体)，可溶性纤维蛋白，凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)，纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合物(PIC)，和纤溶酶原(PLG);心血管相关标记物如氧化的LDL，脑钠肽(BNP)，和脂蛋白(a) (Lp(a));代谢相关标记物如脂连蛋白和血红蛋白Ale (HbAlc);肿瘤标记物如癌胚抗原(CEA)，α-胎蛋白(AFP), CA19-9，CA125，和前列腺特异性抗原(PSA);传染病相关标记物如乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV),沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis),和淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae);变应原特异性免疫球蛋白E (IgE);激素；和药物。这之中，多价抗原如D-二聚体、CRP、Lp (a)和PLG以及痕量组分如BNP是更优选的。
[0130](稀释液体)
[0131]在本发明中，当样品需要根据样品中的待测对象的浓度来稀释时，可以使用稀释液体。作为稀释液体，可以使用具有任何组成的稀释液体，只要所述稀释液体具有以下作用:不会通过例如显著抑制抗原-抗体反应或者相反显著地促进该反应造成由于标记的过度聚集而不能通过毛细作用前进从而使得不可能检测取决于抗原浓度的抗原-抗体反应的信号。具有这样的作用的稀释液体的实例包括净化水，生理盐水，以及各自pH为6.0至10.0的低浓度缓冲液，如10mmol/L至20mmol/L磷酸盐缓冲液，10mmol/L至20mmol/LTris-HCl缓冲液，和lOmmol/L至20mmol/L甘氨酸-HC1缓冲液。此外，为了控制样品液体在测试条中的前进速率，可以向任何这样的稀释液体中加入表面活性剂。
[0132](测量)
[0133]作为量化来源于胶态金的信号的方法，它足以依据已知方法测量吸光度或反射光强度。通过从吸光度或反射光强度的变化的量外推至具有已知浓度的样品的校准曲线，也可以测量待检测物质的浓度。
[0134]实施例
[0135]接下来，通过实施例的方式具体描述本发明，但是本发明的范围不限于此。
[0136](试验例1)对封闭剂1的研究
[0137]利用商购获得的生物来源或非生物来源的封闭剂对抗体敏化后的胶态金进行胶态金表面的封闭处理。
[0138](1)试验材料
[0139](i)胶态金溶液
[0140]向被加热至65°C的500mL的净化水中加入0.7mL的其中各以7% (w/v)的比率溶解有柠檬酸三铵和柠檬酸三钠二水合物的水溶液，并将整体通过搅拌混合。随后，加入lmL的7% (w/v)的四氯金(III)酸水溶液，使混合物反应10分钟同时搅拌，然后将反应溶液煮沸。之后，将所得物在冰水中冷却以制备平均粒径为30nm的胶态金溶液。用20mmol/LTris缓冲液(pH7.5)将平均粒径为30nm的胶态金溶液调节至10D/mL。
[0141](ii)待测试的封闭剂
[0142]非生物来源的组分
[0143].N101 (由 NOF CORPORATION 生产)
[0144].N102 (由 NOF CORPORATION 生产)
[0145].SN100 (由 NOF CORPORATION 生产)
[0146].NB4025 (由 C0SM0 BIO C0.，LTD.生产)
[0147].Stabil Guard (由 SurModics Inc.生产)
[0148].Protein-Free 封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.)
[0149]生物来源的组分
[0150].BSA(由 Desert Biologicals 生产)[0151] .Blocking Peptide Fragment (由 Τ0Υ0Β0 C0., LTD.生产)
[0152].Neo Protein Saver (由 Τ0Υ0Β0 C0.，LTD.生产)
[0153].StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液(由 PffiRCE 生产)
[0154].酪蛋白(由 VWR International, LLC.生产)
[0155](2)试验方法
[0156]向20mL的10D/mL胶态金溶液(pH7.5)中加入被制备成在10mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)中的溶液的lmL的抗-D- 二聚体单克隆抗体(克隆#672102)，并将该混合物在室温搅拌10分钟。在"非生物来源"的封闭剂的情况中，以以下量将其未稀释的溶液添加到胶态金和抗体的混合溶液中。此外，在"生物来源"的封闭剂的情况中，封闭剂被溶解在20mmol/L Tris缓冲液中从而被制备成10% (w/v)溶液，然后将2mL的该溶液添加到胶态金和抗体的混合溶液中。将混合物搅拌5分钟,然后在10°C并且11，900Xg下离心45分钟。
[0157]除去上清液，然后向所得的残余物添加800 μ L的20mmol/L Tris缓冲液(pH7.2)以悬浮每种情况的缀合物。测量悬浮液在最大吸收波长(λ max)的吸光度和在波长600nm的吸光度，并计算它们的比值(Α,^/Α λ max)。
[0158]〈非生物来源的封闭剂的添加量〉
[0159]N101、N102、Stabil Guard、Protein-Free 封闭缓冲液…2mL
[0160]SN100、NB4025、Protein-Free 封闭缓冲液…0.2mL
[0161](3)检验结果和讨论
[0162]表1显示试验结果。从结果中明显的是，当用N101或N102对抗体敏化的胶态金进行封闭处理，然后离心以收集抗体敏化的胶态金，并且尝试将胶态金再悬浮在20mmol/LTris缓冲液(pH7.2)中时，胶态金发生聚集并且不能被再悬浮，导致不能进行吸光度测量。此外，在用NB4025、SN100、Stabil Guard或Protein-Free处理的情况中，离心后的再悬浮同样较差，尽管程度比上述两种要轻，并且吸光度也显示高的值。另一方面，在用生物来源的组分，即，BSA、Blocking Peptide Fragment、Neo Protein Saver、Starting Block 或酪蛋白处理的每种情况中，胶态金不发生聚集并且能够被再悬浮，并且吸光度也显示低的值。
[0163]如从以上可看出的，用生物来源的组分封闭处理过的胶态金当在对抗体敏化的胶态金进行离心后再悬浮时的可分散性优异，并且可用作缀合物。另一方面，用非生物来源的组分封闭处理过的胶态金具有的问题在于:通过离心，抗体敏化的胶态金聚集，并且因此，不能被再悬浮或显著缺乏稳定性。
[0164][表 1]
[0165]
【权利要求】
1.一种缀合物，所述缀合物包含具有用抗体或抗原敏化的表面的胶态金属，其中所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA;酪蛋白；丝胶蛋白；对应于作为大肠杆菌(Escherichia coli)来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；NE0 PROTEINSAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和Protein-Free封闭缓冲液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中所述甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:聚氧乙烯单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
6.一种用于样品中的待检测物质的检测方法，所述检测方法包括使所述样品与缀合物接触，所述缀合物包含具有用抗体或抗原敏化的表面的胶态金属，所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中所述缀合物被携带在用于免疫层析法的测试条上。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA;酪蛋白；丝胶蛋白；对应于作为大肠杆菌(Escherichiacoli)来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；ΝΕΟPROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的检测方法，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；StabilGuard ;和 Protein-Free 封闭缓冲液。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的检测方法，其中所述甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:聚氧乙烯单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氢呋喃单甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯单甲基丙烯酸酯。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的检测方法，其中所述待检测物质包括多价抗原。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其中所述待检测物质包括D-二聚体。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的检测方法，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
14.一种用于免疫层析法的测试条，其包括以下组分:(1)缀合物垫，所述缀合物垫携带缀合物，所述缀合物包含具有用第一抗体或抗原敏化的表面的胶态金属，所述胶态金属的表面用非生物来源的组分和生物来源的组分封闭；和(2)不溶性膜，所述不溶性膜包含与所述缀合物和待检测物质的复合物结合的第二抗体，所述不溶性膜被设置在作为组分(1)的所述缀合物垫的下游。
15. 根据权利要求14所述的测试条，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
16.检测设备，其包括:根据权利要求14或15所述的用于免疫层析法的测试条；以及外壳。
17.一种用于包含用抗体或抗原敏化的胶态金属的缀合物的制备方法，所述制备方法包括:(a)用抗体或抗原敏化胶态金属以提供缀合物；(b)通过使所述缀合物与非生物来源的组分和生物来源的组分接触，从而对所述胶态金属的表面进行封闭处理；和(c)通过离心对经过所述封闭处理的所述缀合物进行浓缩。
18.根据权利要求17所述的缀合物的制备方法，其中所述生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:BSA ;酪蛋白；丝胶蛋白；对应于作为大肠杆菌来源的热休克蛋白(HSP)的DnaK的氨基酸序列的氨基酸419至607的多肽；NEO PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封闭缓冲液；和 Stabil Coat。
19.根据权利要求17或18所述的缀合物的制备方法，其中所述非生物来源的组分包括选自由以下各项组成的组中的一种或多种:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封闭缓冲液。
20.根据权利要求17所述的制备方法，其中所述步骤(b)包括通过使所述缀合物与所述非生物来源的组分接触，然后使所述缀合物与所述生物来源的组分接触，从而对所述胶态金属的表面进行所述封闭处理。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的制备方法，其中所述胶态金属是胶态钼或胶态金。
【文档编号】G01N33/553GK103635804SQ201280032686
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】横川伸也, 山本光章, 清水知 申请人:积水医疗株式会社