专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷 浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平 衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦 然。血桨中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙 磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积 在骨组织，>70时，可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织 的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷 酸盐阴离子(H2PO -， HP042')。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法， 染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分 析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无 机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入 非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能 比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nrn或325nrn直接测定磷铂酸杂聚化 合物，方法简便，便于自动化。但黄疽，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收， 必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的 中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法 (Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye) 或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm波长处吸光度的上 升，得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 无机磷诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动 生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。
本发明无机磷浓度测定方法原理如下-磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子
+谷氨酸+腺苷三磷酸 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+
水+辅酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+
过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase ; EC6.3丄2)酶(偶) 联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶 (glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)
酶促反应速率比色法。谷氨酰胺合成酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸 根)酶解产生氨离子。丙氨酸脱氢酶的酶促作用使氨离子变成丙氨酸。甘氨 酸氧化酶作为循环酶将丙氨酸再次变回氨离子，使谷氨酰胺合成酶酶解无机 磷产生的氨离子不断地被重复循环利用。同时甘氨酸氧化酶的作用也循环不 断地生成过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)作为显色酶， 通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从 而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不 同而定)波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原 (Quioneiminedye) —含量高低的光吸收大小速度，得出无机磷浓度大小测 定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺 10 mmol/L
腺苷二磷酸 20 mmol/丙酮酸
20 mmol/L
谷氨酰胺合成酶
10000U/L
丙氨酸脱氢酶
12000U/L
甘氨酸氧化酶
12000U/L
过氧化物酶
30000 U/L
还原型色原体组合
-20 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻卩定胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
对组合:3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺。 本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺
合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷 二磷酸、丙酮酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢 酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、 丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷 二磷酸、丙酮酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、 过氧化物酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、谷氨酰胺合成酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、 丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L. 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺 10mmol/L 腺苷二磷酸 20 mmol/L
丙酮酸 20 mmol/L
谷氮酰胺合成酶 10000 U/L丙氨酸脱氢酶 12000 U/L甘氨酸氧化酶 12000 U/L过氧化物酶 30000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试主波 长505nm,测试副波长600nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟 左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓度大小。 实施例二本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氮基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 谷氨酰胺 腺苷二磷酸 丙酮酸幽mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸0.2 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂谷氨酰胺合成酶甘氨酸氧化酶 过氧化物酶100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L12000U/L12000U/L30000 U/L4-氨基抗砒 0.6 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm,被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例三本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 .稳定剂 还原型辅酶100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L谷氨酰胺腺苷二磷酸丙酮酸.甲基-2-苯噻唑酮崩宗10 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L 0.6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂试剂3甘氨酸氧化酶过氧化物酶双甲基苯胺三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂簡mmol/L 500 mmol/L12000U/L12000 U/L30000 U/L 2 mmol/L100 mmol/L500 mmol/L谷氨酰胺合成酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间io分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/30，反 应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左 右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原 体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不 另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器 得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子 +谷氨酸+腺苷三磷酸氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+ 水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出无机磷浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂还原型辅酶谷氨酰胺腺苷二磷酸丙氨酸脱氢酶 1000——80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000——80000 U/L过氧化物酶 500——80000 U/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨 酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体 组合组成单剂试剂。4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨 酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体 组合组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺、 腺苷二磷酸、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定 齐U、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原 型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨 酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧 化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷 氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨 酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组 合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶组成。过氧化物酶、 还原型色原体组合、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷 氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂l、试剂2或试剂3 中的位置可以不限。6. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 齐U 1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1. 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒1^乙基~~1^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒1.N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐 4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出无机磷浓度的大小。
文档编号C12Q1/00GK101324619SQ200710023379
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司