一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米药物，具体涉及一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物，常表现为机体局部的异常组织产生肿块。肿瘤的形成，是在各种致瘤因素作用下，细胞生长调控发生严重紊乱的结果。过去十年里，全球癌症发病率增长了 22 %，未来还将以每年千分之一的比例递增，肿瘤已成为威胁人类健康乃至生命的头号杀手。化疗是治疗肿瘤的的主要手段，传统的抗肿瘤药物主要包括阿霉素、紫杉醇、喜树碱、顺铂等。但由于对这些药物对肿瘤细胞缺少特异选择性，大多数病人不得不忍受化疗药物带来的严重的毒副作用，生活质量的下降，以及反复的治疗疗程。为了有效提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，从而减轻患者的痛苦，研究一种理想的化疗模式即将化疗药物在准确的时间递送至准确的病灶部位，并保证药物具有足够长的作用时间成为亟需解决的问题。
[0003]纳米技术是在现代物理学、化学和工程技术相结合的基础上诞生的高技术学科，其核心是利用纳米材料的特殊性能，来实现普通材料所不能达到的功能和用途。纳米药物载体是指通过物理或化学的方式将药物分子包载在纳米材料载体上，形成药物-载体的复合体系，其具有显著提高靶区的药物浓度，从而改善药物的利用率和治疗效果，并降低不良反应等优点。本发明利用H2N-PEG-COOH修饰具有低毒性、高生物相容性和表面易修饰等特性的纳米钻石，合成纳米钻石-聚乙二醇载体，明显提高了纳米钻石的分散性，减弱了其易在人体组织中聚集的特性。最后通过静电作用使纳米钻石-聚乙二醇载体吸附阿霉素从而制备得到纳米钻石药物，并研究了该药物的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。所制备的纳米钻石药物分散性较好。
[0005]本发明提供的一种负载阿霉素的纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤:
[0006](I)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC, 0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化的羧基化纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1Μ、ρΗ为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)沉淀物；
[0007](2)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H) Img,按每毫克ND-PEG-C00H加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为8.0的硼酸缓冲溶液中，超声分散I小时形成悬浊液，再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时后，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用0.1Μ、ρΗ为8.0的硼酸缓冲溶液继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，制得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)纳米药物，真空干燥，冷藏，避光保存。
[0008]与现有技术相比本发明的有益效果:本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。本发明所得到的纳米药物分散性较前期研究尤为突出，可以保持四天才沉降，而且随着时间的延长疗效也强于游离阿霉素。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)在硼酸缓冲溶液作用下，物理吸附阿霉素，制备得到ND-PEG/D0X纳米药物，通过流式细胞仪检测细胞摄取ND-PEG/D0X实验，表明ND-PEG/D0X可以进入细胞，从而诱导细胞凋亡；经体外肿瘤细胞转运机制表明ND-PEG/D0X具有能量依赖，是网格蛋白决定机制进入细胞；经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该纳米药物不仅可以降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，而且能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，所以ND-PEG/D0X可在制备抗肿瘤药物中应用。
【附图说明】
[0009]图1各种纳米颗粒的紫外吸收光谱图
[0010]图2各种纳米颗粒的分散性照片图
[0011]图3不同pH对纳米药物ND-PEG/D0X体外释药的影响
[0012]图4A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的散点图
[0013]图4B流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG/D0X的散点图
[0014]图5A流式细胞仪检测MCF-7细胞的荧光强度图
[0015]图5B流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG/D0X的荧光强度图
[0016]图6A不同浓度的纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养H印G2细胞活性的影响
[0017]图6B不同浓度的纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养HeLa细胞活性的影响
[0018]图6C不同浓度的纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养MCF-7细胞活性的影响
[0019]图7A纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养不同时间IfepG2细胞活性的影响
[0020]图7B纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
[0021]图7C纳米药物ND-PEG/D0X对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
[0022]图8 MCF-7细胞内吞纳米药物ND-PEG/D0X的机制
【具体实施方式】
[0023]以下为实施例中使用的材料:
[0024]纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm, Ireland)。
[0025]阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11.HCl,分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司，规格按C27H29NO11.HCl计算为10mg。
[0026]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
[0027]硼酸(H3BO3，分子量为61.83)为天津市风船化学试剂科技有限公司生产。
[0028]氢氧化钠(NaOH，分子量为39.99)为北京北化精细化学品有限责任公司生产。
[0029]实施例1
[0030](I)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)纳米粒子的制备
[0031]准确称取1.0mg羧基化纳米钻石，分别经过二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(C2H5OH)、蒸馏水(H2O)洗涤后，置于1.0mL MES(0.1M、ρΗ5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入0.2mg EDC,0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，待反应结束后以15000rpm高速离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
[0032]把活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1.0mL BBS (0.1M、pH8.4)缓冲溶液中，超声分散1min形成悬浊液，接着加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用蒸馈水继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。把未反应的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干净的烧杯中静置，待测定ND-PEG-C00H纳米颗粒上偶联H2N-PEG-COOH的质量。
[0033]精确称取Img H2N-PEG-COOH,用BBS (0.1M，pH8.4)溶解并定容于1ml的比色管中，分别量取0.8ml, 0.56mL、0.4ml, 0.16ml,0.08mL置入2ml的EP管中，按摩尔比向其中入相应体积的荧光胺，再加入一定体积使溶液总体积为2mL，立即涡流10秒，放置5分钟，采用荧光分光光度法设激发波长为385nm，测485nm处的荧光强度，以H2N-PEG-COOH摩尔浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制H2N-PEG-COOH标准曲线。据标准曲线公式，用反应前加入H2N-PEG-COOH的总量减去反应后上清液中H2N-PEG-COOH质量，即得到每毫克ND粒子偶联 H2N-PEG-COOH 的量为 0.15mg。
[0034](2)纳米钻石-聚乙二