醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)纳米药物的制备
[0035]称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH) Img,加入ImL硼酸缓冲溶液(BBS, 0.1Μ，ρΗ 8.0)，超声分散I小时形成悬浊液，接着加入0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇勾仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH 8.0)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)纳米药物，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4°C冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-C00H纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素480nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-C00H吸附阿霉素质量约(99±1.04)微克。
[0036]实施例2
[0037](I)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)纳米粒子的制备同实施例1
[0038](2)纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)纳米药物的制备
[0039]称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH) lmg,加入ImL硼酸缓冲溶液(BBS，0.1Μ，ρΗ 8.0)，超声分散I小时形成悬浊液，接着加入0.1mg阿霉素(DOX)，避光于摇勾仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH 8.0)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4°c冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素480nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-C00H吸附阿霉素质量约(46±1.36)微克。
[0040]实施例3
[0041]纳米粒子的紫外吸收光谱图
[0042]配置一系列D0X、ND、ND-PEG, ND-PEG/D0X的稀溶液，且在测试前将ND、ND-PEG,ND-PEG/D0X在蒸馏水中超声分散，使其形成均一悬浊液，测定它们的紫外吸收曲线，以此判断纳米颗粒ND-PEG/D0X上是否存在化疗药物D0X。
[0043]图1为所制备纳米颗粒的紫外吸收光谱图，由图可知，纳米药物ND-PEG/D0X的吸收曲线与游离药物DOX的相比，前者虽因分散系中颗粒的散射而导致吸收强度增大，但仍出现了属于DOX的特征吸收峰，而纳米载体ND-PEG并没有DOX特征峰出现，说明ND-PEG/DOX纳米颗粒上确已负载化疗药物D0X。
[0044]实施例4
[0045]纳米粒子的分散性研究
[0046]在蒸馏水中分别配置2mL 100 μ g/mL的ND、ND-PEG和ND-PEG/D0X悬浊液放于玻璃比色皿中，用封口膜封口，静置，避光保存并观察，分别于O、5、27、45、69、93h进行拍照记录其分散性的研究。
[0047]图2为所制备纳米颗粒的分散性研究照片图，由图可知，ND在45h以后已经几乎沉降，而ND-PEG却还未沉降，表明用H2N-PEG-COOH修饰ND后，可以明显提高其分散性。纳米药物ND-PEG/D0X在经过69h后也未沉降，而是在静置93h后才出现沉降，与前期研究作对比，发现该药物的分散性明显强于其它药物。
[0048]实施例5
[0049]不同pH对纳米药物ND-PEG/D0X体外释药的影响
[0050]纳米药物ND-PEG/D0X 的体外释放实验在 37 °C 下 PBS (0.01M，pH 5.0)、PBS (0.01M,pH 6.5)、PBS (0.01M，pH 7.4)三种条件下进行。分别取三分等量纳米药物ND-PEG/D0X悬浊分散于相应介质溶剂中并放入释放用透析袋中，透析袋分别浸入9mL上述三种缓冲溶液介质中，置于37°C恒温震荡仪中，在每个取样时间点，取走2mL溶液用于紫外测试，另外补加2mL对应的新鲜透析溶剂。取出的2mL溶液通过阿霉素(DOX)在485nm处的吸光度从而测定其含量。
[0051 ] 图3为纳米药物ND-PEG/D0X在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在酸性条件 PBS (0.01M, pH 5.0)、PBS (0.01M, pH 6.5)下，纳米药物 ND-PEG/D0X 的释放率大于正常生理条件PBS (0.01M，pH 7.4)下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，当PH值接近肿瘤细胞溶酶体的pH环境(5.0)时，累积释药率达到约为65 %。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG/D0X释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了 ND-PEG/D0X在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG/D0X可以应用于肿瘤治疗。
[0052]实施例6
[0053]流式细胞仪检测体外MCF-7细胞摄取纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)实验
[0054]取对数生长期的MCF-7细胞以2.0X 105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃除上清液，PBS洗涤三次，本实验中用实施例1制备的ND-PEG/D0X纳米药物，加入ND-PEG/D0X (含5 μ g/ml D0X)纳米药物于37°C孵育2h，孵育完毕，收集细胞，加入buffer缓冲液，通过流式细胞仪测定其红色荧光强度(488nm激发波长)信号，以未做任何处理的细胞为对照。
[0055]图4A和图4B为MCF-7细胞的前向散射光强度(forward scatter intensity,FSC)和侧向散射光强度(side scatter intensity, SSC)的散点图，FSC反映细胞的相对大小，SSC反映细胞内颗粒物质的复杂程度，颗粒越多，SSC散射强度就越大。由图4B和图4A比较，观察到当ND-PEG/D0X纳米药物与细胞作用后的SSC信号明显强于细胞本身的SSC强度，表明细胞内的颗粒物增多，这是由于纳米药物ND-PEG/D0X大量进入细胞内导致，说明了 ND-PEG/D0X纳米药物可以进入MCF-7细胞。而两者FSC的强度没有明显差异，表明细胞的大小基本未发生变化，说明纳米药物对细胞本身性质不会产生影响。由于DOX以488nm为激发波长时，在500-700nm有荧光信号产生，因此通过检测细胞内ND-PEG/D0X的荧光强度，间接反映细胞摄取ND-PEG/D0X量的多少。图5A是未经处理的细胞所检测到的荧光信号强度，是细胞自发荧光，即细胞内部的荧光分子经光照射后所产生的荧光；图5B是含5 μ g/mlDOX的ND-PEG/D0X与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，可以看到，用ND-PEG/D0X处理细胞的荧光强度明显大于细胞本身的荧光强度，再次表明ND-PEG/D0X已进入细胞，与图4结果一致。
[0056]实施例7
[0057]不同浓度ND-PEG/D0X纳米药物对人肝癌细胞0fepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)活性的影响
[0058]将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10% FBS/DMEM培养基，5% CO2, 37°C )按每孔5X 13个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200 μ L 10% FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A =ND-PEG 10 μ g/mL、ND-PEG/DOX 10 μ g/mL (含 DOX I μ g/mL) ；B: ND-PEG 30 μ g/mL、ND-PEG/DOX 30 μ g/mL (含DOX 3 μ g/mL) ；C:ND-PEG 50 μ g/mL、ND-PEG/DOX 50 μ g/mL (含 DOX 5 μ g/mL) ；D:ND-PEG70 μ g/mL、ND-PEG/DOX 70 μ g/mL(含 DOX 7 μ g/mL) ；E:ND-PEG 90 μ g/mL、ND-PEG/DOX90 μ g/mL (含DOX 9 μ g/mL)，每组均以未处理的H印G2、HeLa, MCF-7细胞为空白对照组，每组设置6个复孔，培养72h后每孔加入20 μ L 5mg/mL MTT的PBS溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，每孔加入150 μ L DMS0，均匀振摇lOmin，进行酶标仪上机检测。
[0059]图6A为各药物组对体外IfepG2细胞增殖的影响，图6B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图6C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，发现纳米材料载体ND-PEG在不同浓度条