一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用与流程

本发明涉及电化学纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，提供一种氨基碳量子点-脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体在金电极表面自组装修饰制备的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又称呕吐毒素，是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中；以这些被DON污染的谷物籽实加工成食品，DON也随之进入粮食制品中，造成食品污染。DON是全球分布最广的霉菌污染性毒素，特别特别在中国、美国、南非、阿根廷和日本。DON是一种剧毒或中等毒性的生物毒素，可致呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，与贫血、免疫抑制、克山病相联系；也与食管癌、胃癌具有密切联系。如我国林县、磁县，在面粉和玉米中的DON检出率分别为53.8％和100％，林县样品(玉米)中DON平均含量(范围是384～9686ng/g)，磁县玉米和面粉中的DON平均含量分别为7959ng/g和1032ng/g，林县、磁县也是我国胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区。随着人们生活水平不断提高，以大小麦为主要原料加工生产的啤酒、麦芽饮料的消费量和人群不断增大，DON能从天然污染大麦和小麦通过麦芽转移到麦芽饮料和啤酒中。因此，这些饮料中DON的含量监控对人们健康生活具有重要意义。目前检测DON的方法主要有色谱法、酶联免疫等。色谱法对操作技术要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生化试剂，而且这些生化试剂很容易失活等不足；酶联免疫法简单、快速，但该法所需DON高效、特异的单抗等制备工艺复杂，且易出现假阳性等问题；中国发明CN 102559686 A公开了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体并应用于DON的检测，中国发明201610132667.6公开了检测真菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，这些方法都是基于DON核酸适体荧光法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇。光分析法与电化学分析法均为仪器设备简单、快速有效的分析方法，但荧光法易受内源性物质荧光的干扰。电化学方法是测定电化学信号，故不受内源性物质荧光的干扰，而且，电化学还有易于自动化、智能化和网络化的优点。

技术实现要素：

针对现有检测技术存在的不足，本发明提供了一种简单、快速、灵敏的、高特异性的能检测超痕量脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用。

碳量子点具有环境友好、制备工艺简单、原料来源广泛，特别是大量含碳可再生有机废弃材料，都可以用来制备碳量子点，可以变废为宝。更为重要的是，碳量子点具有奇异的光电特性、高催化活性和优良的生物相容性，并且极易进行氨基、羧基、巯基等功能化，非常适合制备具有优异性能的光化学、电化学生物复合物，非常适合构建电化学生物传感研究平台。因而氨基碳量子点生物复合物修饰电极在化学分析和生物分析中具有广泛的应用。

核酸适体(Aptamer)是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其分子量较低，没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输，适体是以SELEX技术，通过重复选择的过程从化学合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的，理论上任何分子都能找到其相应的适体，由于核酸适体的高特异性，可以制备高选择性化学生物传感器件，实现目标分子/物质的高选择性检测。

自组装膜技术是活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的有序分子组装体系，可以在分子水平上按人们预期的目标进行设计。自组装膜可以按预先设计，通过精确的化学控制，在电极表面构建特定的结构与功能的自组装传感膜，在化学及生物传感与分子识别等领域具有显著的优点和广泛的应用前景。

本发明将氨基碳量子点和DON Aptamer通过自组装的方式，在电极构建氨基碳量子点-DON Aptamer复合膜；应用碳量子点优异的电学性质与放大功能，DON核酸适体的高特异性制备高选择性、高灵敏的DON电化学生物传感器；在核酸适体荧光传感中，往往存在内源性物质的背景荧光干扰；而在电化学传感检测中，由于采集的是电信号，则可有效地克服内源性物质(荧光信号)的干扰，电化学适配体生物传感具有更高的检测灵敏度和特异性。因此，能充分发挥了二者各自的优势，增强了对DON的检测能力，并充分发挥了自组装技术优点，制得了具有高灵敏度和高特异性DON电化学生物传感器。

本发明的技术方案为：

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法，脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器包括(商品)金电极，和在金电极的金基底表面自组装氨基碳量子点-DON核酸适体传感膜，其通过在金电极基底表面修饰一层氨基碳量子点-DON核酸适体自组装传感膜制备而成，具体包括如下步骤：

(1)金电极预处理，先依次用粒经为1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉对金电极进行打磨、抛光，然后将金电极依次置于HNO₃-HCl溶液、二次去离子水、乙醇中进行超声清洗，再将金电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中进行电化学清洗处理，得到表面光洁的金电极；

(2)将预处理的金电极置于pH为5.0、浓度为10mmol/L的巯基丙胺-醋酸溶液中，室温下自组装24小时后取出，用二次去离子水冲洗干净；

(3)将步骤(2)所得电极浸入质量分数为5％的戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次去离子水冲洗干净；

(4)将步骤(3)所得金电极侵入10mg/mL氨基碳量子点溶液中，在室温下自组装3～7小时，取出，用二次去离子水反复冲洗干净；

(5)将步骤(4)所得金电极浸入5mmol/L的硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(6)将步骤(5)所得金电极浸入质量分数为5％的戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(7)将步骤(6)所得金电极浸入1μmol/L的氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体水溶液中，在室温下孵化12-24小时，取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(8)将步骤(7)所得金电极浸入5mmol/L的硼氢化钠水溶液中1小时，取出，再用二次去离子水反复冲洗干净，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器。

进一步地，所述的氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体为5’-H₂N-AAAAAGCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGG GGGATCGTTA AGGA AGTGCC CGGAGGCGGT ATCGTGTGAA GTGCT-3’。

进一步地，所述的1μmol/L氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液是指，浓度为1μmol/L氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体-0.05mol/L、pH＝5.0的Tris-HCl溶液，并经水浴中加热至95℃并保持5分钟，然后并迅速冷却至室温的溶液。

进一步地，所述的HNO₃-HCl溶液中，HNO₃、HCl的体积比为3:1。

上述制备方法得到的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的应用，其特征在于，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器为工作电极，对溶液中DON进行测定，其步骤如下：

(A)将1.646克铁氰化钾、2.212克亚铁氰化钾和7.45克氯化钾置于1000mL容量瓶中，用浓度为10m mol/LpH 7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(简称PBS)溶解，然后，再向容量瓶中继续加入浓度为10m mol/L的pH7.4的PBS溶液至800～850mL,摇匀,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀释至刻度，摇匀，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探针溶液，将其置阴凉处密闭保存备用；

(B)将待测DON加入pH＝7.4，浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，配制成DON标准浓度系列溶液；

(C)将脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器依次分别浸入步骤(B)所配制的DON标准浓度系列溶液中，40分钟后，取出，用二次去离子水充分冲洗，得DON-核酸适体传感器；

(D)取步骤(A)制备的探针溶液10mL置于电解池中，以步骤(C)所得DON-核酸适体传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，置于电解池的探针溶液中，进行电化学交流阻抗R_et测试，并建立阻抗值R_et与DON的浓度关系式。

DON浓度为9ng/L～10μg/L的范围内,与所测得的交流阻抗值R_et呈良好线性关系，线性关系式为R_et(KΩ)＝12.21+18.06×log(C_DON/μg/L)，检出限为3ng/L。

在实际样品啤酒和麦芽饮料中DON测定中，先取这些饮料适量，以超声法除去其中的二氧化碳和泡沫，然后取除去了二氧化碳和泡沫的啤酒或麦芽饮料用pH＝7.4浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液稀释至刻度，得到实际样品溶液；将脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器浸入2ml实际样品溶液中，40分钟后取出，用二次去离子水充分冲洗传感器后，转入10ml探针溶液中，测定R_et值，依据DON浓度与R_et值的关系，测定样品中DON。

本发明的有益效果在于：

本发明采用自组装法在金电极表面修饰一层氨基碳量子点-DON核酸适体复合物，使传感器既具碳量子点优异的电化学特性和信号放大特性，又具有核酸适体的高特异性，本发明的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器具有快速、灵敏、特异性强的优点，检测DON含量的方法可直接应用于啤酒、麦芽饮料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量测定，方法简单、经济、快速；而且，脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备简便、成本低廉。

附图说明

图1为本发明脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的敏感膜结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。值得说的是，以下实施例中的单位M表示mol/L。

实施例1

脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法为：

(1).进行金电极预处理，先依次用粒经为μm、μm、μm的Al₂O₃粉对金电极进行打磨、抛光，然后将金电极依次置于HNO₃-HCl(体积比为3:1)溶液、二次去离子水、乙醇中进行超声清洗，再将金电极置于1M的H₂SO₄溶液中进行电化学清洗处理，得到基底表面光洁的金电极；

(2).氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液预处理，将浓度为1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加热至95℃，并在95℃下保持5分钟，然后将其立即置于冰水浴中迅速冷却至室温，待用，后续所用1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液即为该溶液。

(3).将预处理的金电极置于pH＝5.0的10mM巯基丙胺-醋酸溶液中，室温下自组装24小时后取出，用大量二次蒸馏水冲洗干净；

(4).将(3)制备的电极，浸入5％戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(5).将(4)所得到的金电极浸入10mg/mL氨基碳量子点溶液中，在室温下自组装3小时，取出，用二次去离子水反复冲洗干净；

(6).将(5)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(7).将(6)所得到的金电极，浸入5％戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次去离子水冲洗干净；

(8).将(7)所得到的金电极浸入1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体水溶液中，在室温下孵化24小时，取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(9).将(8)所得到的金电极25mM乙二醇胺水溶液中3小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(10).将(9)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，取出，然后用二次去离子水反复冲洗干净，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器。

实施例2

(1).进行金电极预处理，先依次用粒经为μm、μm、μm的Al₂O₃粉对金电极进行打磨、抛光，然后将金电极依次置于HNO₃-HCl(体积比为3:1)溶液、二次去离子水、乙醇中进行超声清洗，再将金电极置于1M的H₂SO₄溶液中进行电化学清洗处理，得到基底表面光洁的金电极；

(2).氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液预处理，将浓度为1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加热至95℃，并在95℃下保持5分钟，然后将其立即置于冰水浴中迅速冷却至室温，待用，后续所用1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液即为该溶液。

(3).将经(1)预处理过的洁净的金电极置于pH＝5.0的10mM巯基丙胺-醋酸溶液中，室温下自组装24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(4).将(3)制备的电极，浸入5％戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(5).将(4)所得到的金电极浸入10mg/mL氨基碳量子点溶液中，在室温下自组装5小时，[取出，用二次去离子水反复冲洗干净；

(6).将(5)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(7).将(6)所得到的金电极，浸入5％戊二醛水溶液中，12小时后取出，用二次去离子水冲洗干净；

(8).将(7)所得到的金电极侵入(2)制备的1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体水溶液中，在室温下孵化12小时，取出，用二次去离子水冲洗干净；

(9).将(8)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器。

实施例3

(1).进行金电极预处理，先依次用粒经为μm、μm、μm的Al₂O₃粉对金电极进行打磨、抛光，然后将金电极依次置于HNO₃-HCl(体积比为3:1)溶液、二次去离子水、乙醇中进行超声清洗，再将金电极置于1M的H₂SO₄溶液中进行电化学清洗处理，得到基底表面光洁的金电极；

(2).氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液预处理，将浓度为1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加热至95℃，并在95℃下保持5分钟，然后将其立即置于冰水浴中迅速冷却至室温，待用，后续所用1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体溶液即为该溶液。

(3).将经(1)预处理的洁净的金电极置于pH＝5.0的10mM巯基丙胺-醋酸溶液中，室温下自组装24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(4).将(3)制备的电极，浸入5％戊二醛水溶液中，24小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(5).将(4)所得到的金电极浸入10mg/mL氨基碳量子点溶液中，在室温下自组装7小时，取出，用二次去离子水反复冲洗干净；

(6).将(5)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(7).将(6)所得到的金电极，浸入5％戊二醛水溶液中，18小时后取出，用二次蒸馏水冲洗干净；

(8).将(7)所得到的金电极浸入按(2)制备的1μM氨基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体水溶液中，在室温下孵化24小时，取出，用二次去离子水冲洗干净；

(9).将(8)所得到的金电极浸入25mM乙二醇胺水溶液中3小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净；

(10).将(9)所得到的金电极浸入5mM硼氢化钠水溶液中1小时，然后取出，电极用二次去离子水反复冲洗干净，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器。

实施例4

(1).探针溶液的制备将1.646克铁氰化钾、2.212克亚铁氰化钾和7.45克氯化钾置于1000mL容量瓶中，用浓度为10m mol/LpH 7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入浓度为10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大约至800mL),摇匀,然后再以10m mol /L的pH7.4的PBS溶液稀释至刻度，摇匀，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探针溶液，将其置阴凉处密闭保存备用。

(2).DON标准溶液配制，精确称取1.0mg DON标准物质置于2ml小烧杯中，用少量pH＝7.4，浓度为0.1M Tris-HCl缓冲溶液溶解，定量转移至的100ml容量瓶中，用上述Tris-HCl缓冲溶液定容，摇匀，得到浓度为10μg/ml的DON标准溶液；置于暗处备用；取13只25ml洁净的容量瓶，分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13，配置DON浓度依次为50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.50ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.01ng/ml、0.009ng/ml、0.005ng/mL、0.001ng/mL、和试样空白Tris-HCl缓冲溶液的标准系列，该DON标准系列溶液以DON标准溶液用用Tris-HCl缓冲溶液稀释而成。

(3).将脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器浸入2ml(2)所配制的标准系列溶液中，40分钟后取出，用大量二次去离子水冲洗干净。

(4).取(1)所制备的探针溶液10ml置于电解池中，以经(2)处理过的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，将工作电极、参比电极和辅助电极置于电解池中，测定交流阻抗值R_ct，DON的浓度在9ng/L～10μg/L范围,与R_ct成线性关系，线性方程为R_et(KΩ)＝12.21+18.06×log(C_DON/μg/L)，检测限为3ng/L。

实施例5

啤酒样品脱氧雪腐镰刀菌烯醇回收率测定

(1)啤酒样品处理：某品牌啤酒样品1从某超市购得，本底DON值为38.5μg/L，量取30ml啤酒样品置于100ml烧杯中，以超声波超声脱气至无二氧化碳气泡和泡沫备用；实施例4中所用啤酒均该品牌啤酒；啤酒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇回收率测定的试液均用该啤酒配置。

(2)啤酒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇回收率测定的试液配置：取20只10ml容量瓶，分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4和D5；精确量取称取300μl啤酒样品5份，分别置于编号为A1、A2、A3、A4、A5的容量瓶中，然后再向编号为A1、A2、A3、A4、A5容量瓶中分别加入1.0ml浓度均为10μg/L的DON标准溶液；再精确量取150μl啤酒样品5份，分别置于编号为B1、B2、B3、B4、B5的容量瓶中,然后再向编号为B1、B2、B3、B4、B5容量瓶中分别加入300μl浓度均为10μg/L的DON标准溶液；再精确量取30μl啤酒样品5份，分别置于编号为C1、C2、C3、C4、C5的容量瓶中,然后再向编号为C1、C2、C3、C4、C5容量瓶中分别加入50μl浓度均为10μg/L的DON标准溶液；再精确量取3μl啤酒样品5份，分别置于编号为D1、D2、D3、D4、D5的容量瓶中,然后再向编号为D1、D2、D3、D4和D5容量瓶中分别加入50μl浓度均为1μg/L的DON标准溶液；再分别向A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4和D5加入pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液5ml，摇匀，再用pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，即得到DON在啤酒样品中回收率测定的试样溶液，备用。

(3)探针溶液配置：将1.646克铁氰化钾、2.212克亚铁氰化钾和7.45克氯化钾置于1000mL容量瓶中，用浓度为10m mol/LpH 7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入浓度为10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大约至800mL),摇匀,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀释至刻度，摇匀，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探针溶液，置于阴凉处备用；另取10ml探针溶液置于电解池中，供测定交流阻抗用。

(4)啤酒试样中DON回收率测定：将实施例2制备的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器置于2ml按(2)浸入的DON回收率测定的试样溶液中，40分钟后取出，传感器用二次去离子水冲洗干净，然后将脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(辅助电极)置于电解池的探针溶液中进行交流阻抗值测定；依据脱氧雪腐镰刀烯醇的含量与交流阻抗的关系，求出DON的量，据此测得DON的回收率依次分别为97.5％、95.8％、96.7％、103.6％、94.5％；95.6％、98.6％；109.3％、97.6％、104.8％；98.4、99.2％、102.7％、107.3％、104.4％；101.5％、98.4％、96.3％、93.2％和95.7％；以上数据表明，回收率都保持在较高的水平，这说明用本发明的方法对DON含量进行检测，准确率高。

实施例6

啤酒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定。

(1)啤酒样品处理：从某超市购买得六种不同品牌的啤酒，分别将这些啤酒记为A、B、C、D、E和F；分别取A、B、C、D、E和F的啤酒样品10ml，置于50ml烧杯中，以超声波超声至无二氧化碳气泡和泡沫待用。

(2)啤酒试液制备：取18只10ml容量瓶，分别编号为A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3；D1、D2、D3；E1、E2、E3；F1、F2和F3；精确量取100μl A啤酒样品3份，分别置于编号为A1、A2、A3的容量瓶中，精确量取100μl B啤酒样品3份，分别置于编号为B1、B2、B3的容量瓶中，精确量取100μl C啤酒样品3份，分别置于编号为C1、C2、C3的容量瓶中，精确量取100μl D啤酒样品3份，分别置于编号为D1、D2、D3的容量瓶中，再精确量取100μl F啤酒样品3份，分别置于编号为F1、F2和F3的容量瓶中，然后向编号为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3；F1、F2和F3容量瓶中分别加入pH＝4.7，浓度为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液5ml摇匀，再向各容量瓶加入pH＝4.7，浓度为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液至刻度，摇匀，即制得啤酒试样溶液，待用。

(3)探针溶液配置：将1.646克铁氰化钾、2.212克亚铁氰化钾和7.45克氯化钾置于1000mL容量瓶中，用浓度为10m mol/LpH 7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入浓度为10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大约至800mL),摇匀,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀释至刻度，摇匀，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探针溶液，置于阴凉处备用；另取10ml探针溶液置于电解池中，供测定交流阻抗用。

(4)啤酒中DON的测定：将实施例2制备的脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器置于2ml按(2)浸入的啤酒试样溶液中，40分钟后取出，传感器用二次去离子水冲洗干净，然后将脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(辅助电极)置于电解池的探针溶液中进行交流阻抗值测定；依据脱氧雪腐镰刀烯醇的含量与交流阻抗的关系，求出DON的量，据此测得A、B、C、D、E和F不同品牌啤酒中DON的含量分别以秩为2.65μg/L、2.74μg/L、2.86μg/L；36.8μg/L、37.5μg/L、36.2μg/L；1.16μg/L、1.28μg/L、1.31μg/L；35.5ng/L、40.6ng/L、38.2ng/L；11.5ng/L、11.8ng/L、12.1ng/L；19.6ng/L、20.9ng/L和21.1ng/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南科技大学

<120> 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用

<130> 20161108

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

maaaaagcat cactacagtc attacgcatc gtagggggga tcgttaagga agtgcccgga 60

ggcggtatcg tgtgaagtgc t 81