浓缩成可见的线状染色体的过程，与成细 线的染色体区段共定位；至偶线期ASYl与染色体完全重合，ZYPl在配对的同源染色体间 积累，促使配对的两条细线同源染色体形成联会的粗线，ZYPl与成粗线的染色体区段共定 位；至粗线期染色体完全联会，ZYPl信号与染色体完全重合，而ASYl从染色体上解离进入 胞质，成弥散状；染色体上ZYPl信号随着粗线期之后联会复合体解体而解离。观察突变体 细线期、偶线期和粗线期两种蛋白的动态变化，没有发现它们的装载与解离与野生 型的差异（图7)。
[0078] 为了检验突变是否会影响减数分裂重组过程中双链断裂修复（DSBR)环节 的DNA合成。我们采用免疫荧光的方法观察γ -H2AX的定位和变化。γ -H2AX是H2AX被 磷酸化后了的一种形态，定位在双链断裂位置附近的核小体上，作为一种定位信号，起着招 募修复复合体行使修复双链断裂的作用。因此可以用γ_Η2ΑΧ来指示DSB。DSB从细线晚 期在SP011-1的作用下开始形成，到偶线早期DSB数量到达顶峰，随着修复的进行，到粗线 后期DSB完全修复。γ -Η2ΑΧ信号与之同步。在/7〇以3-7的偶线期，γ -Η2ΑΧ约有185± 16 (η=32)个信号，与野生型中的189±26 (η=39)个信号无差别（图3-12);进入粗线期后，野 生型中信号骤降至57±12 (η=55)，但是中仍然可见残留113±27 (η=19)信号。 于此同时，我们也检测了 RAD51在这两个时期的定位。RAD51是一个重组酶，在减数分裂中 最主要的功能被认为是与双链断裂后其中一端的单链结合，介导单链入侵附近的同源染色 体区段产生杂合双链，从而行使后续修复的作用。传统的观点认为RAD51参与了所有DSB 的修复，所以RAD51信号数量与Υ-Η2ΑΧ类似，又晚于后者的出现和解离。RAD51信号在野 生型和/7〇/为-7的偶线时期可观察到188±24个（η=15)与187±11个（η=14)，没有 显著差异；而到粗线期野生型中只剩下51±14 (η=70)，而突变体中却仍可见多达87±15 (η=5)的信号点。说明了突变体/7〇/为-7中：双链断裂的形成正常；然而双链断裂修复发生 了延滞。原因可能是突变造成了 DNA合成效率的降低（图8 )。
[0079] 在拟南芥终变期细胞中，MLHl与细胞学结构中多数的交叉结重合指示type I CO 的数量。因此通过观察为-i中终变期MLHl的信号数量而了解中type I途径CO 数，结果显示突变体中MLHl信号相对应野生型减少，说明突变体中减少了 type I 的重组途径（图l〇D，E)。
[0080] 实施例9花粉母细胞同源重组频率的检测 我们分析花粉母细胞同源重组的频率主要基于一套花粉的可视系统的帮助（Francis and Lam et al·，2007; Berchowitz and Copenhaver, 2008)。基本原理如下：首先构建 焚光标记株系（FTL, fluorescent-tagged line)，通过构建一系列由减数分裂后特异表达 启动子LAT52驱动不同荧光蛋白表达的背景的转基因植株，筛选定位于同一条染色体 的带不同荧光标记的转基因植株(转基因植株带有不同的荧光蛋白基因，且荧光蛋白基因 在四分体中特异表达，因此，可以观察到带有不同荧光组合的四分体。背景的拟南芥花 粉母细胞减数分裂的产物一一四分体被包在一起，不会分开，可以方便观察和统计)。由于 减数分裂过程中同源染色体分离，非同源染色体自由组合，标记基因可以直接在花粉中观 察得到。标记间如果发生交换或没有交换都可以观察得到。以我们用到的13为例，在该株 系中三号染色体上有三个不同位点分别带有CFP，YFP和RFP荧光标记，如（图12)所示， 杂合的该植株的减数分裂过程姊妹染色单体都带有荧光标记，同源染色体没有标记，若该 区段同源染色体间不发生交换，如A型所示，同一个四分体中有两个花粉粒有三种荧光，另 外两个没有荧光；若发生G型的四线双交换，则同一个四分体中会形成一个只带红色和一 个只带蓝色的花粉，和一个带有红色和绿色的花粉，以及一个带有蓝色和绿色的花粉。由于 不同的交换总共有12中组合，通过统计后代不同的组合的花粉粒的数目，可以计算这三个 荧光标记间的重组频率，通过Tail-PCR等技术可以知道这些标记间的物理位置。
[0081] 为-7会产生约2/3的活性花粉粒，这使我们可以通过基于花粉的可视分析 系统分析COs的频率。通过将为-7与荧光位点纯合背景的检测系进行杂交，通 过观察带荧光四分体花粉中荧光的变化（图13Β)定量估计突变体重组频率。其中I2a、I2b、 I3a、I5c和I5d是由两侧不同荧光蛋白定义的5个位于2号、3号和5号染色体臂上的区 域（图13A)。观察这些区域发现除了 I3a，/7〇/为-7中其它区段重组频率显著增加，而观察 /7〇7为-7中缺一个花粉粒的四分体中的减数分裂重组频率，发现I2b、I3a和I5d区段和野 生型没有差异；I2a段重组频率显著增加；而在I5c中重组频率却显著下降。因此突 变确实改变减数分裂重组频率（图10A，B，C)。
【主权项】
1. 一种如SEQIDNO. 1所示的P0L2A蛋白质，包括不同的功能结构域：从N端到C端 分别为：氮末端结构域、3' -5'外切酶活性结构域、5' -3'聚合酶活性结构域、中央催化活性 结构域、PCNA结合结构域和锌指结构域。2. 一种鉴定如SEQIDNO. 1所述拟南芥基因的三个突变体材料： SALK_096341C、CS6947与SALK_124217基因型的引物，这三个突变体材料依次命名为 /7〇7为-7、和其特征在于引物核苷酸序列为SEQIDNO. 4-SEQIDNO. 13 所示，其中，突变体为-i基因型鉴定引物(基因组带):SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5,突变 体以3-7基因型鉴定引物（T-DNA插入带):SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7,突变体以3-之 点突变测序引物：SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9,突变体基因型鉴定引物（基因组 带）观0 10肌10和5￡0 10肌11，突变体/7〇以3-15基因型鉴定引物（1'-0嫩插入带）：5￡0 IDNO. 12和SEQIDNO. 13。3. -种确定P0L2A在减数分裂重组中具体功能的方法，其特征在于具体步骤如下： (1) 获得相应的弱突变体；或者构建一个由减数分裂特异表达的启动子驱动的RNAi载 体，并获得阳性转基因植物； (2) 运用常规细胞生物学技术，分析花粉粒的活性、四分体的碱性品红染色及展片法观 察突变体花粉母细胞减数分裂过程，确定该基因影响减数分裂的具体环节； (3) 通过染色体荧光原位杂交，分析P0L2A基因所影响同源染色体的相互作用事件，免 疫荧光实验分析突变体中可能参与的减数分裂过程中的各种蛋白的定位和变化，进一步确 定该基因在减数分裂中的功能； (4) 通过多突变体之间的杂交，分析该基因与不同重组遗传通道中基因间的遗传互作， 如5^77、似/^7、麗/5S7等，双纯合材料与各自单突变体的减数分裂表型比较后，确定该基 因在通路中的位置； (5) 利用荧光标签位点系统，通过统计后代四分体不同的荧光组合的花粉粒数目，计算 出几种荧光标记间的重组频率，从而分析出该基因影响减数分裂重组频率或分布情况； (6) 根据现有的研宄结果，结合已知的该基因的具体生化功能，综合得出该基因在减数 分裂中的具体功能。4. 一种用于体外检测和中在减数分裂过程中基因表达的 方法，其特征在于具体步骤为：取突变体未开花的花序，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用 DNaseI消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析，荧光定量 PCR引物核苷酸序列如SEQIDNO. 14~SEQIDNO. 27所示，其中，RealTimePCR内参引 物：SEQIDNO. 14和SEQIDNO. 15，RealTimePCR检测 /7〇7为-7和 冲在减数分 裂过程中基因表达的PCR引物：SEQIDNO. 16~SEQIDNO. 27。5. -种启动子驱动的减数分裂时期特异干涉的构建载体和转基因株 系，具体为：选择一段近N端在两个基因中完全一样的约400bp碱基序列作为靶标序列构建 到含有启动子的RNAi载体中，进行农杆菌转化，从而获得减数分裂时期特异的P0L2 功能缺失突变体材料，扩增引物核苷酸序列为SEQIDNO. 28和SEQIDNO. 29。6. 如权利要求2中所述的拟南芥基因的弱突变体/7〇以3-7和/7〇以3-迹]植株 表型和雄性减数分裂异常，具体为通过植株的观察和细胞学实验，确定/707为-7和/7〇7为-之 的减数分裂异常表型。7. -种利用荧光原位杂交的实验，确定/7〇7为-7突变体中染色体相互作用情况的方 法，具体为：利用地高辛标记位于拟南芥基因组一号染色体长臂近端粒端BACF1N21，通过 观察突变体雄性减数分裂过程中该信号与野生型的差异，确定突变体中 存在非同源染色体的相互作用。8. -种利用免疫荧光实验观察突变体/707^3-7突变体中联会复合体能否正确形成的 方法，具体为：通过联会复合体形成相关蛋白ASYl与ZYPl在突变体和野生型中定位的比较 来分析。9. 一种利用免疫荧光实验观察突变体/7〇7力-7突变体中Y-H2AX和RAD51的定位和 变化，从而确定P0L2A突变是否影响了减数分裂重组过程中双链断裂修复的方法。10. -种利用免疫荧光的方法观察MLHl蛋白在终变期野生型和突变体中定 位，进而确定是否影响干涉敏感型重组过程的方法。11. 一种利用遗传通路分析在拟南芥减数分裂过程中作用机制的方法，其特征 在于：通过将减数分裂未知突变体与已知减数分裂过程中上下游的若干关键基因突变体的 杂交，分析F2群体中双纯合材料的减数分裂表型与纯合亲本表型的异同。12. -种通过杂交在/70/23-7突变体中引入荧光标签位点系统，通过统计后代四分体 不同的荧光组合的花粉粒数目，研宄影响减数分裂重组频率或分布的方法。13. -种利用拟南芥P0L2A在减数分裂重组中的功能，在定向改变作物的重组频率， 进行作物遗传育种中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体为拟南芥POL2A基因在减数分裂重组中的功能及其应用。本发明包含利用编码POL2A蛋白的序列特征和该基因在减数分裂中新功能的鉴定，如利用荧光标签位点系统分析了POL2A对减数分裂重组频率和分布的影响，并且提供含有荧光标签的遗传材料；提供如何分析完全突变导致胚胎死亡的基因在减数分裂中的功能，及一系列细胞生物学的技术等。本发明第一次在真核生物中证明了POL2A在减数分裂重组的重要功能；并利用该功能，运用现代生物技术方法，通过控制遗传物质在减数分裂过程中的重组频率，达到加速优良性状的聚合，减缓优良性状在杂种后代中的分离，达到推进和提高育种研究的水平。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/54, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104928303
【申请号】CN201510235760
【发明人】王应祥, 马红, 黄霁月
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月11日