，突变体与野生型没有明显差异。双线期早 期联会解除，形成与偶线期相似的细胞形态，至此突变体仍未发现任何明显的异常。联会复 合体完全消失后染色体开始浓缩，在同源染色体间形成经典的"平行双线一一交叉结"的双 线期形态。然而在多数的为-7和/70^3-茨田胞中，浓缩的染色体间似乎存在更多的联 系，使染色体像一团胡乱缠绕的毛线一般，难以辨认出同源染色体。野生型染色体进入到终 变期后，可见形态清晰对称的5对同源染色体形成的二价体，而在突变体的有些细胞中，虽 然从浓缩层度可以判断已进入终变期，但染色体间仍存在除交叉结以外的联系，不能形成 完整5对独立二价体；有些细胞中形成结构非对称的"类二价体";还有一些细胞中不能形 成二价体一一可数的染色体(对)数多于5,暗示可能存在单体。到中期I，突变体多数细胞 内染色体间的联系仍然可见，导致被纺锤丝牵拉后同源染色体分离不同步，到后期I出现 明显染色体桥以及碎片。前期II，可见细胞内到处散落的染色体碎片。中期II的分离过程 中仍产生大量染色体碎片，致使末期II形成多于4个的细胞核，在减数分裂之后产生多分 体，最终发育为败育花粉粒（图3)。
[0016] 本发明还提供通过Real Time PCR检测/?〇以3-7和中在减数分裂过程中 基因表达的方法。具体步骤为：取突变体未开花的花序，用TRIzoI法抽提水稻RNA， 并用DNaseI消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析。荧 光定量PCR引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 14~SEQ ID NO. 27所示，其中，Real Time PCR 内参引物：SEQ ID NO. 14和 SEQ ID NO. 15, Real Time PCR 检测 /7〇7为-7和 冲在 减数分裂过程中/??%基因表达的PCR引物：SEQ ID NO. 16~SEQ ID NO. 27 (即Pl-P 6)。检测结果显示为-7在分子水平上实际是一个转录水平下降了的弱突变；而 的转录水平相比野生型显著增加，可以推测其是一个造成P0L2A功能残缺的点突 变（图4)。
[0017] 本发明还提供/70以3-247〇Ua-J反式结合子、RNAi干涉/??凍达的转基因材料和 两个拷贝双纯合的植物材料。同时提供各个材料的雄性减数分裂及花粉粒活 性的表型（图5)。其中，提供利用fllCV启动子驱动的减数分裂时期特异干涉的 建载体和转基因株系。具体为：通过序列比对发现拟南芥中存在基因与相似 度达84%，考虑到两个基因可能在减数分裂中的功能冗余，选择了一段近N端 在两个基因中完全一样的约400bp碱基序列作为靶标序列构建到含有fllCV启动子的RNAi 载体中，进行农杆菌转化，从而获得减数分裂时期特异的P0L2功能缺失突变体材料，扩增 引物核苷酸序列为SEQ ID NO. 28和SEQ ID NO. 29。
[0018] 本发明还提供通过荧光原位杂交的实验，利用地高辛标记位于拟南芥基因组一号 染色体长臂近端粒端BAC F1N21，从而确定/707为-7突变体中染色体相互作用情况的方法。 并提供为-i突变体中该BAC信号的变化情况（图6)，进而提供在/7〇以3-7突变体中存 在非同源染色体的相互作用的证据。
[0019] 本发明还提供一种利用免疫荧光实验观察突变体/70以3-2突变体中联会复合体 能否正确形成的方法。具体是通过ASYl与ZYPl蛋白在/7〇/为-7突变体中定位和野生型进 行比较，结果论证了 影响同源染色体配对而非联会（图7)。
[0020] 本发明还提供一种利用免疫荧光实验观察突变体突变体中γ -H2AX和 RAD51的定位和变化，从而确定P0L2A突变是否影响了减数分裂重组过程中双链断裂修复 的方法（图8)，结果显示/7〇/为-7突变体双链断裂的形成正常，然而双链断裂修复发生了延 滞，从而推测突变可能造成了 DNA合成效率的降低。
[0021] 本发明还提供一种通过统计野生型和突变体在减数分裂起始后不同时 间点减数分裂不同时期细胞数目，从而分析得到突变体花粉母细胞减数分裂过程出现延 滞，DSB修复效率降低这一推论的方法（图8C)。
[0022] 本发明还提供一种利用遗传通路分析在拟南芥减数分裂过程中作用机制 的方法。具体为通过将减数分裂未知突变体与已知减数分裂过程中上下游的若干关键基 因（如5^77、似/^7、麗/5S7等）突变体的杂交，分析F2群体中双纯合材料的减数分裂表 型与纯合亲本表型的异同（图9)，可以从遗传角度判定未知基因起功能的环节。同时本发 明提供突变体分别与·5/7〇77-7-7、rat/57-J、r/b7_么rcA-7、皿突变体杂交获 得的植物材料和各个双突变体的减数分裂表型，具体表型结果为：1. /707^3-75/7077-7-7 双突变表型近似于5/7077-7-7,说明的遗传学位置位于5^77-7作用的下游；2. 双突变具有类似单突表型，同样说明的遗传学位置位于 似的下游；3. 双突变，没有发现明显表型加重趋势，与rfcl-2相近，暗 示/??%参与type I重组途径中DSB修复的DNA合成环节。4. /7〇Ua-7rd-7双突变体出 现类似/?〇以a-冲非同源染色体相互作用，说明/??%参与type I重组中DSB修复的DNA 合成要早于故XfZ^D-Ioop的环节；5. /7〇以3-7皿5^7-7双突变体出现比两种单突变体更 严重的非同源染色体缠绕表型，表明/??%功能独立于麗参与的type II重组途径，而 作用于type I重组途径。
[0023] 本发明还提供一种利用免疫荧光的方法观察MLHl蛋白在终变期野生型和突变 体为-7中定位，进而推测是否影响type I重组过程的方法。具体观察结果为 /7〇7^3-7中MLHl蛋白定位减少，说明其减少了 type I重组（图10)。
[0024] 本发明还提供一种利用焚光标签位点系统（Fluorescent Tag Loci System， FTL)，通过统计后代四分体不同的荧光组合的花粉粒数目，可以计三种荧光标记间的重组 频率，从而研宄/??%影响减数分裂重组频率或分布机制的方法（图10)。
[0025] 基于上述内容，本发明提供了确定P0L2A在减数分裂重组中具体功能的方法，以 模式植物拟南芥为例，具体步骤如下： (1) 由于P0L2A是有丝分裂必需的基因，完全缺失导致胚胎死亡，常规途径很难研宄其 在减数分裂中的功能。一种途径是获得相应的弱突变体；另外需要构建一个由减数分裂特 异表达的启动子驱动的RNAi载体，并获得阳性转基因植物； (2) 运用文中描述的常规细胞生物学技术，分析花粉粒的活性、四分体的碱性品红染色 及展片法观察突变体花粉母细胞减数分裂过程等，确定该基因影响减数分裂的具体环节； (3) 通过染色体荧光原位杂交，分析P0L2A基因所影响同源染色体的相互作用事件，如 配对。免疫荧光实验分析突变体中可能参与的减数分裂过程中的各种蛋白的定位和变化， 进一步确定该基因在减数分裂中的功能； (4) 通过多突变体之间的杂交，分析该基因与不同重组遗传通道中基因间的遗传互作， 如5^77、似/^7、麗/5S7等，双纯合材料与各自单突变体的减数分裂表型比较后，确定该基 因在通路中的位置； (5) 利用焚光标签位点系统（Fluorescent Tag Loci System，FTL)，通过统计后代四分 体不同的荧光组合的花粉粒数目，计算出几种荧光标记间的重组频率，从而分析出该基因 影响减数分裂重组频率或分布情况； (6)根据现有的研宄结果，结合已知的该基因的具体生化功能，综合得出该基因在减 数分裂中的具体功能。
[0026] 本发明通过研宄，确定了拟南芥P0L2A在减数分裂重组中的功能。
[0027] 本发明方法中： 步骤（1)中所述获得相应的弱突变体，即为前述的
[0028] 步骤（1)中所述构建一个由减数分裂特异表达的启动子驱动的RNAi载体，并获得 阳性转基因植物；包括：体外检测/7〇7为-7和中在减数分裂过程中基因表 达；利用fliCV启动子驱动的减数分裂时期特异干涉的构建载体和转基因株系。
[0029] 步骤（2)中所述运用常规细胞生物学技术，分析花粉粒的活性、四分体的碱性品 红染色及展片法观察突变体花粉母细胞减数分裂过程，确定该基因影响减数分裂的具体环 节，包括拟南芥基因的弱突变体为-7和的植株表型和雄性减数分裂异 常，具体为通过植株的观察和细胞学实验，确定/7〇7为-7和的减数分裂异常表型。
[0030] 步骤（3)的操作包括：利用荧光原位杂交的实验，确定/7〇7为-7突变体中染色体相 互作用情况；利用免疫荧光实验观察突变体为-7突变体中联会复合体能否正确形成； 利用免疫荧光实验观察突变体/7〇7力-7突变体中γ -H2AX和RAD51的定位和变化，从而确 定P0L2A突变是否影响了减数分裂重组过程中双链断裂修复；利用免疫荧光的方法观察 MLHl蛋白在终变期野生型和突变体A?a-7中定位，进而确定是否影响干涉敏感型 重组过程。
[0031] 步骤（4)的操作包括：利用遗传通路分析在拟南芥减数分裂过程中作用机 制，具体通过将减数分裂未知突变体与已知减数分裂过程中上下游的若干关键基因突变体 的杂交，分析F2群体中双纯合材料的减数分裂表型与纯合亲本表型的异同。
[0032] 根据上述内容，本发明归纳了 DNA聚合酶epsilon参与减数分裂type I(干涉敏感 型交换)的重组过程的具体方式。具体如图11所示：在野生型中，减数分裂过程中由SPOll 剪切形成双键断裂后，RAD51相关的重组酶的作用下在同源染色体间介导单链入侵，在type I重组过程中进行DSB修复，其中由POLe负责一条完整的前导链的合成，由POL δ进行后 随链若干冈崎片段的合成后由DNA连接酶连接成完整的链。而在POLe突变体（p〇12a_l、 pol2a_2)中，由于POLe功能丧失或减弱，在进行type I重组过程是，如果两个干涉敏感的 交换位点比较相近，则由POL δ代替POLe进行短链DNA合成，完成DSB修复（图11C);而如 果交换位点相聚较远，POLS无法完成长片段的合成，则会由type II (干涉不敏感型交换） 通路完成DSB修复，这时候需要合成的DNA片段就会相对较短，可以由POL δ代替完成（图 11D);在/?? f突变体中还存在着不能正确识别同源染色体，在DNB形成后，DNA单链入侵 到非同源染色体间，造成了突变体中非同源染色体之间相互作用的情况，不能正确完成DSB 修复，从而导致了育性降低（图11E)。
[0033] 本发明中，涉及到若干其他基因和蛋白：5洲77-7介导切割双链、形成DSB的作用； 似游2位于57视7-7的下游，能够结合单链介导单链入侵；参与依赖于MSH4的干涉敏 感型途径的COs的形成，在DNA双链断裂修复中参与DNA后随链的合成；TtO被认为是拟南 芥中酵母基因 MTP旅]同源基因，MTPJ作为一个解旋酶，酵母中的工作证明了其功能是扩 展D-Ioop使得产生更多的杂合双链促进dHJ的形成，为ZMM依赖的干涉敏感重组途径所必 需；麗/5S7介导了干涉非敏感的type II类型的重组；ASYl和ZYP分别是拟南芥参与形成 联会复合体的侧