一种新型肝脏枯否氏细胞吞噬纳米药物粒子的组合抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种新的肝脏枯否氏(Kuppfer)细胞吞噬纳米药物粒子抑制剂组合物及其在纳米药物的应用。

背景技术：

大多数纳米递药系统(Nano-scale Drug Delivery System,NDDS)进入体内后，在实现药效、减少毒副作用的同时，体内单核吞噬系统(Mononuclear Phagocyte System，MPS)主要包括肝脏枯否氏细胞(Kupffer Cell,KC)和脾脏的巨细胞等会引起大量纳米粒子在非靶组织尤其是肝脏和脾脏蓄积(参考文献[1-2])，既大大减少了药物在靶组织的分布，也极可能引起相应脏器毒性，限制了靶向药物载体的应用。如何减少载药纳米粒子被肝脏等单核吞噬系统清除，实现纳米粒子在靶组织更有效地分布是纳米递药系统研究中亟待解决的关键问题之一(参考文献[3-4])。这对于提高靶向纳米药物生物利用度、增强药物对病变部位的靶向性，进而提高疗效和降低毒副作用具有重要意义。

纳米粒子被免疫细胞识别并吞噬，严重影响其有效性和毒性，虽然目前还不十分清楚机体对纳米粒子免疫识别以及在生物溶酶中稳定的机制，但对其识别机制的认识将成为纳米粒子设计的重要部分(参考文献[5])。设计非球形的载体材料是一种十分有潜力的逃逸MPS的方法(参考文献[6])。周志敏助理研究员先后报道了聚乳酸(PLA)非球形药物(表阿霉素)载体(参考文献[7])和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纤维状和棒状非球形微粒(参考文献[8])，以期设计出更有利于逃逸MPS的载体。

影响纳米粒子被内吞的因素还有纳米粒子尺寸以及表面理化特征如电荷、亲疏水性和表面功能基团等(参考文献[9])。粒径在200nm以下的纳米粒子容易逃避MPS的识别，粒径减小，MPS的吞噬作用减弱；表面电荷也可影响MPS的摄取，表面电荷绝对值减小，其吞噬也减少；将材料中连接具有亲水性的物质如 聚乙二醇(PEG)(参考文献[10])等，能提高疏水性物质的溶解性，将特异性吸附减到最少，很大程度上减少MPS吞噬，延长循环时间，并且提高肿瘤特异性靶向作用。

另外，从免疫细胞吞噬机制角度通过合理调控细胞行为无疑对于解决NDDS的MPS问题也具有十分重要的意义。越来越多的研究者正在关注纳米递药系统与吞噬系统的相互作用(参考文献[11-12])，纳米粒子的吞噬途径、被摄取过程的数学模型及相关参数均正逐渐被认识和建立(参考文献[13])。纳米粒子的摄取主要通过内吞(endocytosis)途径进行，内吞是一类受到精密调控的复杂过程，其入胞机制目前尚无一致结论。纳米粒子的尺寸、形状、电荷、所组成的材料以及表面的修饰基团等均影响纳米粒子进入吞噬细胞。可能的内吞途径包括以下几种：巨胞饮(macropinocytosis)、胞饮(pinocytosis)、网格蛋白依赖性内吞(clathrin-dependent endocytosis)、小凹蛋白依赖性内吞(caveolin-dependent endocytosis)以及依赖肌动蛋白的吞噬途径(phagocytosis)等。谷婧丽等(参考文献[14])研究发现，几乎所有的内吞信号通路都参与了超顺磁性铁纳米粒子(SPION)进入RAW264.7巨噬细胞的过程，包括吞噬和吞饮的多条信号通路。Lunov课题组(参考文献[13])研究表明超小顺磁性氧化铁(USPIO)和超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子是通过网格蛋白介导和清道夫受体介导的内吞进入人巨细胞的。理解细胞内吞(endocytosis)的机制和粒子进入细胞的途径等问题有助于预测粒子在细胞中的位置和分布，为限制吞噬细胞内吞提供了思路，也为设计出更有效的载体提供实验依据。

另一方面，研究表明巨噬细胞对纳米粒子的吞噬和炎症细胞因子分泌具有一定关系(参考文献[15])，纳米粒子作为“异物”进入机体，激活炎症反应途径，引起炎症细胞因子分泌。炎症反应与NF-kB信号通道激活的关系已经得到证明(参考文献[16])，NF-kB信号通道前炎症细胞因子TNF-α和IL-1均可被微生物产物脂蛋白LPS激活，介导炎症的发生，因此从NF-kB信号通道进行调控，为纳米粒子逃逸吞噬提供了可能。

多糖材料良好的生物安全性使得该类纳米递药系统在药物传输领域有着广阔的应用前景(参考文献[17])。普鲁兰多糖(pullulan)是一种水溶、中性直链多糖，其独特的连接方式赋予了普鲁兰一些独特的理化性质，在医药方面受到越 来越多研究者的关注(参考文献[18])。申请者前期工作中以普鲁兰多糖为原料，合成了乙酰普鲁兰(PA)及其叶酸偶合体(FPA)，制备了形态规则、性质稳定的自组装纳米粒子和载药纳米粒子，探讨了载体对所包载药物表阿霉素(EPI)的缓释作用(参考文献[19-20])，并应用人宫颈癌Hela裸鼠动物模型，考察了FPA载药纳米粒子(FPA/EPI)的体内分布特征。前期研究显示：此类纳米粒子制备过程简单，方法可靠，纳米粒子在水溶液中至少可以保持两个月粒径和表面电位未见明显改变，具有较好的稳定性；大鼠药代动力学实验结果表明，FPA对所包载药物EPI具有明显的缓释作用，并明显改变EPI体内分布特征，FPA/EPI对动物的胃肠毒性减小，其抗肿瘤作用时间延长，具有一定的肿瘤靶向作用，但由于肝脏Kupffer细胞的吞噬作用，肝脏中的EPI含量明显高于游离药物组(见图1)，使之应用受到限制。

现有文献中，同时应用吞噬途径抑制剂和核因子-kB(NF-kB)信号通道抑制剂使载药纳米粒子逃逸吞噬的方法尚未见报道。发明人在前期研究基础上，同时应用炎症细胞因子和吞噬途径抑制剂使FPA/EPI避免肝脏KC细胞吞噬，以实现纳米粒子在体内的长循环，增加药效，减少毒副作用，为实现纳米药物逃逸免疫细胞吞噬提供科学依据，以上研究未见任何文献或专利报道。

以下文献部分或者整体引入本专利说明书，作为其组成部分。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的抑制肝脏枯否氏细胞吞噬纳米药物粒子的组合抑制剂，同时包括炎症细胞因子抑制剂和吞噬途径抑制剂。

本发明的另一目的是，提供一种肝脏枯否氏细胞吞噬纳米粒子的组合抑制剂在制备相应纳米药物粒子中的用途，所述组合抑制剂同时包括有效量的炎症细胞因子抑制剂和吞噬途径抑制剂。

通过如下技术方案来实现上述发明目的。本发明所述的新的抑制肝脏枯否氏细胞吞噬纳米药物粒子的组合抑制剂，包括炎症细胞因子抑制剂和吞噬途径抑制剂。具体来说：

(1)所述的吞噬途径抑制剂是以下抑制剂中的一种或多种：巨胞饮(macropinocytosis)抑制剂如阿米洛利(Amiloride,AMR)、胞饮(pinocytosis)、网格蛋白依赖性内吞(clathrin-dependent endocytosis)抑制剂氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)、小凹蛋白依赖性内吞(caveolin-dependent endocytosis)以及依赖肌动蛋白的吞噬途径(phagocytosis)抑制剂。

(2)所述的炎症细胞因子抑制剂是以下抑制剂中的一种或多种：NF-kB信号通道特异抑制剂为四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)以及其他炎症因子抑制剂地塞米松等。

(3)所述纳米药物粒子由以下纳米粒子包载药物：乙酰普鲁兰叶酸偶合体 纳米粒子、乙酰普鲁兰纳米粒子以及其他以多糖为原料合成制备的纳米粒子。

本发明思维独特，加入的各项试剂易得，对于实现纳米粒子在体内的长循环，更好地实现药效，减少毒副作用具有重要的意义。

在给予纳米药物的同时，同时应用炎症因子抑制剂和纳米粒子被肝脏细胞吞噬的吞噬途径抑制剂，可望实现减少纳米药物被肝脏KC吞噬，延长其在体内的循环时间，更好地实现药效，减少毒副作用，具有临床应用前景。

附图说明

图1所示为静脉注射5mg/kg EPI及FPA/EPI后各肝、脾、肺和肾的表阿霉素含量(n＝5,ng/g)

具体实施方式

将NF-kB信号通道特异抑制剂和吞噬途径抑制剂同时应用于KC摄取纳米粒子，考查炎症细胞因子的分泌情况，验证本发明的双向作用抑制剂的效果。采用体外试验方法，细胞培养板包括96孔板和/或6孔板，将炎症细胞因子抑制剂和吞噬途径抑制剂与细胞共孵育一段时间，加入载药纳米粒子，应用ELISA方法考察肝脏KC分泌炎症细胞因子的情况。

[实施例1]从NF-kB信号通道和吞噬途径同时抑制KC细胞分泌炎症因子

根据参考文献提取原代KC，培养细胞48h，用0.25％胰酶/EDTA消化后，调细胞密度接种于96孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞充分贴壁融合率达80％时，吸弃培养基，加入抑制剂，抑制剂剂量如下：氯丙嗪(CPZ)7μg/mL，阿米洛利(AMR)50μM/mL，制霉素(NY)50μg/mL，四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)10μM/mL。37℃孵育24h，吸弃抑制剂溶液后用PBS洗3次，加入FPA/EPI纳米粒子悬液(根据参考文献20制备)，37℃孵育2h，各孔取上清100ul加入酶标板，按照ELISA试剂盒说明书测定细胞因子水平；破碎细胞，萃取后，荧光定量法测纳米粒子吞噬EPI含量，根据OD比值(抑制百分率＝(1-ODt/ODc)×100％)判断抑制剂的抑制吞噬作用。

由表1和表2可见，NF-kB信号通道抑制剂PDTC可显著减少炎症因子的分泌和纳米粒子的摄取。由此说明，NF-kB信号通道抑制剂能够有效抑制肝脏枯否 氏细胞吞噬纳米药物粒子。当同时加入PDTC和CPZ、AMR或者NY两种抑制剂时，细胞因子水平进一步降低，KC吞噬FPA/EPI摄取抑制百分率进一步增加，最高可达85.39％，显著减少纳米粒子被吞噬进入枯否氏细胞，由此说明，同时应用NF-kB信号通道抑制剂PTDC和吞噬途径抑制剂氯丙嗪、阿米洛利或制霉素产生了协同抑制效应。

表1NF-kB信号通道抑制剂和吞噬抑制剂对KC炎症因子水平的影响(pg/mL，)

表2NF-kB信号通道抑制剂和吞噬抑制剂对KC吞噬FPA/EPI摄取抑制百分率的影响(％)

基金信息

北京市自然科学基金，靶向性纳米递药系统FPA/EPI逃逸Kupffer细胞吞噬的作用及机制研究(7132064)